李海萍

(青海大学附属医院肿瘤妇科，青海 西宁 810001)

HIF- 1α、CXCR4及VEGF在子宫内膜癌组织中的表达及意义

李海萍

(青海大学附属医院肿瘤妇科，青海 西宁 810001)

目的 探究缺氧诱导因子(HIF)- 1α及其下游基因趋化因子受体(CXCR)4、血管内皮生长因子(VEGF)在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中的表达及其意义。方法 用逆转录- 聚合酶链反应(RT- PCR)及免疫组织化学技术检测94例子宫内膜癌组织和30例正常子宫内膜组织中HIF- 1α、CXCR4、VEGF mRNA及蛋白的表达情况，并分析其与子宫内膜癌临床病理特征的关系。结果 HIF- 1α、CXCR4、VEGF mRNA及蛋白在子宫内膜癌组织中存在高表达，而在正常子宫内膜组织中几乎无表达。HIF- 1α、CXCR4蛋白表达在正常子宫内膜组织中的表达与子宫内膜癌组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。HIF- 1α和CXCR4蛋白的表达水平与子宫内膜癌的脉管浸润、临床分期及患者术后生存时间相关。结论 HIF- 1α、CXCR4及VEGF在子宫内膜癌组织中表达水平增高,提示HIF- 1α可能通过调控CXCR4及VEGF蛋白的转录,进而促进肿瘤组织新生血管生成而促进子宫内膜癌的发展。

子宫内膜癌；缺氧诱导因子- 1α；超化因子受体- 4；血管内皮生长因子

子宫内膜癌是女性生殖系统最常发生的恶性肿瘤之一〔1〕。子宫内膜癌的转移和侵袭能力是临床分期的重要依据，与患者的预后情况密切相关〔2〕。子宫内膜癌属于实体肿瘤，其发生及转移过程中有两个不可或缺的特点，一是肿瘤细胞对低氧条件具有的耐受性，另一个是肿瘤组织内新生血管的再生〔3〕。缺氧诱导因子(HIF)- 1α是哺乳动物在低氧状态下存在于体内的一种异源二聚体转录因子，该因子可与缺氧反应元件的结合形成转录起始复合物，并启动其调控基因如血管内皮生长因子(VEGF)和趋化因子受体(CXCR)4的转录，使得VEGF、CXCR4等受其调控的基因表达水平升高，从而参与组织新生血管生成、细胞无氧代谢和迁移等活动〔4〕。有报道指出，食管鳞状细胞癌、结肠癌、口腔鳞癌、肾透明细胞癌、乳腺癌、恶性胶质瘤中同时存在HIF- 1α及CXCR4高表达〔5〕，而在子宫内膜癌恶性转变过程中HIF- 1α及其下游靶基因的作用尚未明确。本研究通过采用逆转录- 聚合酶链反应(RT- PCR)和免疫组织化学技术分别测量HIF- 1α、CXCR4及VEGF在子宫内膜癌和正常子宫内膜组织中RNA和蛋白质的表达情况，并结合患者临床病理参数及预后进行分析。

1 资料及方法

1.1 临床资料 参照第8版《妇产科学》子宫内膜癌诊断标准，选择2010年1月至2014年4月于青海大学附属医院妇科手术切除子宫内膜癌组织94例及同期因子宫肌瘤手术切取的正常子宫内膜组织36例(经组织病理检查证实)。纳入标准：病理诊断证实、随访资料完整、术前未行放化疗。其中子宫内膜癌组织患者年龄30～72〔平均(58.6±4.9)〕岁，正常子宫内膜组织患者年龄36～70〔平均(51.7±3.4)〕岁。

1.2 方法

1.2.1 mRNA的检测 石蜡标本总RNA使用Relia- PrepTM FFPE Miniprep Systems 试剂盒进行抽提。cDNA使用M- MLV逆转录酶合成。建立25 μl PCR反应体系，包含1 μl上游引物(10 pmol/μl)、2 μl cDNA模板、1 μl下游引物(10 pmol/μl)、8.5 μl去离子水和12.5 μl PCR Master Mix(2倍)，引物设计由广州伯信生物科技有限公司完成，HIF- 1α上游引物:5′- CTACTTGCCATCCTTCA- 3′，下游引物:5′- GTGGTTTTGTGGCTCTTGGTA- 3′;CXCR4上游引物:5′- TTTTGTCACCAGTTCTCTTGGA- 3′,下游引物:5′- AGCCATTATTACACACGTTCC- 3′;VEGF：上游引物:5′- TTCACTATCACAGGAGGACAC- 3′,下游引物:5′- TCCACTGAGAGGGATGAGAACT- 3′。PCR反应条件及时间：采用ABI 2720型PCR仪，先经过10 min 95℃预变性及1 min 95℃变性处理，而后在退火温度下退火1 min，再在72℃下延伸1 min，经过40个循环，最后在72℃下延伸10 min。

电泳方法(产物的定量测定)：将产物置于20 g/L的琼脂糖(含50 g/L溴乙啶)中，电泳后对电泳带进行密度扫描，记录灰度值进行分析统计。

1.2.2 蛋白的检测 采用购自美国Abcam公司的兔抗人HIF- 1α抗体(1∶500)、兔抗人VEGF抗体(即用型)及兔抗人CXCR4抗体(1∶250)检测HIF- 1α、VEGF及CXCR4蛋白。抗兔抗鼠抗体(即用型)及显色系统采用Dako 公司EnVisionTM +System 试剂盒。严格按照试剂盒说明书执行实验步骤，阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替3种一抗，抗体有效性验证参照已知的阳性组织进行。

阅片采用双盲法。细胞质和细胞核均着色为HIF- 1α蛋白阳性的表达结果；细胞质着色为VEGF及CXCR4蛋白阳性的表达结果。观察并将定位明确、背景清晰、有棕黄色颗粒状染色的细胞设定为阳性。阳性细胞比例<10%组织面积为阴性(-)，10%～25%为弱阳性(+)，26%～50%为中度阳性()，>50%为强阳性()。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行秩和检验、χ2检验。

2 结 果

2.1 mRNA的表达 以GAPDH为内参照。HIF- 1α、VEGF及CXCR4 mRNA在子宫内膜癌组织中的表达率分别为82例(87.2%)、65例(69.1%)和73例(77.7%)，而在正常子宫内膜组织中分别为22例(73.3%)、5例(16.7%)、3例(10.0%)。电泳条带显示，VEGF、CXCR4 mRNA在子宫内膜癌组织中的表达水平显著高于正常子宫内膜组织。见图1。

图1 HIF- 1α、VEGF及CXCR4 mRNA在不同组织中的表达

2.2 蛋白的表达 子宫内膜癌组织细胞的细胞质和细胞膜为VEGF及CXCR4蛋白的主要表达部位，正常子宫内膜组织中HIF- 1α、VEGF及CXCR4 蛋白几乎不表达，见图2。子宫内膜癌组织中HIF- 1α、VEGF及CXCR4 蛋白均有高表达，其中HIF- 1α及CXCR4 蛋白的阳性表达率与正常子宫内膜组织相比明显升高(P<0.05)。见表1。

2.3 临床病理参数及预后与蛋白表达的关系 患者肿瘤的分化程度、组织学类型、年龄等参数与HIF- 1α和CXCR4蛋白的表达水平无明显关系(P>0.05)，但与子宫内膜癌的脉管浸润、临床分期明显相关(P<0.05)。见表2。

图2 不同子宫内膜组织中HIF- 1α的表达(×200)

组织学类型nHIF-1α-+VEGF-+CXCR4-+子宫内膜癌9414(14.9)23(24.5)34(36.2)23(24.5)22(23.4)16(17.0)31(33.0)25(26.6)27(28.7)22(23.4)22(23.4)23(24.5)正常子宫内膜3027(90.0)2(6.7)1(3.3)0(0.0)12(40.0)10(33.3)5(16.7)3(10.0)25(83.3)2(6.7)2(6.7)1(3.3)Uc/P值6.760/0.0002.810/0.0054.868/0.000

表2 临床病理参数与HIF- 1α、CXCR4、VEGF表达率的关系(n)

与Ⅲ～Ⅳ期比较：1)P<0.05；与有脉管浸润比较：2)P<0.05

3 讨 论

近年来，女性健康意识的提高以及宫腔镜等技术的逐渐普及使早期子宫内膜癌及癌前病变得以及时发现并积极采取治疗，有研究指出，早期子宫内膜癌患者5年总生存率为98%，5年无病生存率可达93%〔6〕。对于中晚期子宫内膜癌，尤其伴有淋巴结或远处转移者，其预后较差，尽管积极采取各种治疗手段包括手术治疗、放化疗等，其治疗效果仍不理想。

研究发现，HIF- 1α可通过启动其调控基因如VEGF和CXCR4的转录,进而参与组织新生血管生成、细胞无氧代谢和细胞增殖迁移分化等多种病理生理过程〔6～9〕。HIF- 1α在缺氧状态下通过增强VEGF mRNA的转录活性及稳定性，参与肿瘤组织血管的构建〔10〕，随着研究的深入，HIF- 1α及其下游基因CXCR4、VEGF在肿瘤发展及恶化过程中的作用越来受到关注。 Fu等〔11〕发现了肿瘤内微血管密度与HIF- 1α表达水平呈正相关，提示肿瘤生长过程中血管的形成与HIF- 1α有密切关系。邵薇薇〔12〕研究发现相比于正常宫颈组织，宫颈癌组织中CXCR4蛋白的表达水平明显升高，提示CXCR4蛋白的表达水平与宫颈癌的发生和发展有着密切关系。另外，食管鳞状细胞癌、结肠癌、口腔鳞癌、肾透明细胞癌、乳腺癌、恶性胶质瘤中存在HIF- 1α及CXCR4高表达也同样得到证实。

本研究结果提示缺氧可导致组织细胞中HIF- 1α表达水平升高，继而通过调控VEGF及CXCR4等基因的转录参与子宫内膜癌组织血管的生成、癌细胞的无氧代谢及迁移等过程，参与子宫内膜癌的发生、恶化和转移。通过利用调控组织细胞缺氧条件选择性抑制子宫内膜癌的发展和转移是一个新的研究方向，降低HIF- 1α表达水平可以作为治疗子宫内膜癌的方法之一。

1 周俭珊,叶 红.HIF- 1α、VEGF及HIF- 1α/VEGF轴在子宫内膜癌中的表达研究进展〔J〕.海南医学,2015;26(16):2413- 6.

2 石 婷,孙立新.宫颈腺癌早期诊断及预后研究进展〔J〕.中华临床医师杂志(电子版),2015;9(10):154- 8.

3 Yoshida T,Hashimura M,Mastumoto T,etal.Transcriptional upregulation of HIF- 1α by NF- κB/p65 and its associations with β- catenin/p300 complexes in endometrial carcinoma cells〔J〕.Lab Invest,2013;93(11):1184- 93.

4 Feng Z,Gan H,Cai Z,etal.Aberrant expression of hypoxia- inducible factor 1α,TWIST and E- cadherin is associated with aggressive tumor phenotypes in endometrioid endometrial carcinoma〔J〕.Jpn J Clin Oncol,2013;43(4):396- 403.

5 廖 芸.缺氧诱导因子- 1α在子宫内膜癌中的研究进展〔J〕.现代妇产科进展,2014;23(2):141- 3.

6 刘 骥,黄明莉,王宝菊,等.子宫内膜癌血管生成相关因子的研究进展〔J〕.现代生物医学进展,2014;14(9):1790- 2.

7 Saarelainen SK,Staff S,Peltonen N,etal.Endoglin,VEGF,and its receptors in predicting metastases in endometrial carcinoma〔J〕.Tumour Biol,2014;35(5):4651- 7.

8 Coenegrachts L,Schrauwen S,van Bree R,etal.Increased expression of placental growth factor in high- grade endometrial carcinoma〔J〕.Oncol Rep,2013;29(2):413- 8.

9 魏文婷,李 冰,贾晔然,等.慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中缺氧诱导因子1α的表达变化〔J〕.中国病理生理杂志,2013;29(9):1700- 3.

10 Maschio LB,Madallozo BB,Capellasso BA,etal.Immunohistochemical investigation of the angiogenic proteins VEGF,HIF- 1α and CD34 in invasive ductal carcinoma of the breast〔J〕.Acta Histochem,2014;116(1):148- 57.

11 Fu S,Bai R,Zhao Z,etal.Overexpression of hypoxia- inducible factor- 1α and vascular endothelial growth factor in sacral giant cell tumors and the correlation with tumor microvessel density〔J〕.Exp Ther Med,2014;8(5):1453- 8.

12 邵薇薇.CXCR4和CCR7趋化因子受体在宫颈癌中的表达〔J〕.中国妇幼保健,2012;27(5):728- 31.

〔2017- 04- 11修回〕

(编辑 袁左鸣)

李海萍(1972- )，女，副主任医师，主要从事妇科肿瘤研究。

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A

1005- 9202(2017)15- 3782- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.062