江恩利 谭寒星 冉光伟 方 堃 付俊生

(贵州省人民医院妇科，贵州 贵阳 550001)

老年宫颈癌组织中人类白细胞抗原- E蛋白的表达及与临床病理特征的关系

江恩利 谭寒星 冉光伟 方 堃 付俊生

(贵州省人民医院妇科，贵州 贵阳 550001)

目的 探讨人类白细胞抗原(HLA)- E在老年宫颈癌组织的表达及与临床病理的关系。方法 选取2014年1月至2016年6月国际妇产科协会(FIGO)分期为Ⅰ～Ⅱ期的原发性老年子宫颈癌组织标本92例，其中子宫颈鳞癌60例，宫颈腺癌32例。使用免疫组化方法检测标本癌组织和癌旁组织中HLA- E的表达，并用平均光密度值(IOD)表示其在不同组织中的相对表达强度。分析HLA- E表达与临床病理特征的关系。结果 HLA- E在宫颈鳞癌和宫颈腺癌中的表达明显高于正常组织(P<0.01)，而宫颈鳞癌和宫颈腺癌中差异无统计学意义(P>0.05)。进一步分析显示，宫颈鳞癌组织HLA- E的表达与FIGO分期及肿瘤直径有关系(P<0.05)，宫颈腺癌组织HLA- E的表达与患者的FIGO分期及浸润深度有关系(P<0.05)。结论 HLA- E在老年宫颈癌组织中高度表达，与患者FIGO分期的进展、肿瘤直径和浸润深度密切相关，提示可以作为临床上诊断宫颈癌的标志物之一，同时为临床上治疗提供新的思路。

人类白细胞抗原- E；宫颈鳞癌；宫颈腺癌

根据组织病理类型，宫颈癌可分为宫颈鳞癌、宫颈腺癌、宫颈腺鳞癌；其中，宫颈鳞癌发病率最高，其次是宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌〔1，2〕。目前，宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌的发病率并未下降，反而升高〔3〕。在宫颈癌的发生与发展过程中，人类白细胞抗原(HLA)发挥着重要作用，而HLA- E作为一种非经典型主要组织相容性复合体I类分子(MHC- 1)，与经典的HLA- (A,- B,- C)相比，HLA- E具有非多态性且在正常组织的细胞膜上很少表达，而在黑色素瘤、淋巴瘤及神经胶质瘤等肿瘤细胞表面则呈高表达状态，通过与细胞个体活性及其表面受体(CD94/NKG2A)结合而抑制自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的活性，从而使其逃脱免疫系统的攻击〔4〕。HLA- E在正常宫颈上皮中的表达较弱，而当正常宫颈组织感染病毒、转化为癌前病变(CIN Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级)和宫颈癌的过程中，HLA- E的表达逐渐增强〔4〕。本实验研究HLA- E在老年宫颈腺癌和鳞癌组织表达的差异，并进一步分析其与两者临床与病理表现之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2016年6月因宫颈癌于贵州省人民医院行全子宫切除或广泛全子宫切除+盆腔淋巴结清扫术的92例老年患者的癌组织和癌旁组织，其中子宫颈鳞癌组织60例，宫颈腺癌组织32例。纳入标准：符合国际妇产科协会(FIGO)分期〔5〕为Ⅰ～Ⅱa期的患者；年龄≥60岁；术前未进行过放化疗的患者；上述组织标本均能查阅到其所对应的患者的病例资料。排除标准：合并患有心、肝、肾以及内分泌系统疾病者；合并其他较为严重的妇科疾病者。年龄60～79〔平均(66.14±3.29)〕岁。研究过程均取得患者及其家属的同意，并符合医学伦理委员会的相关规定。依据上述组织标本所对应的住院号，查阅相应患者相关的临床病理资料，包括患者年龄、病理诊断、浸润深度、肿瘤大小、FIGO分期等。

1.2 主要试剂和仪器 一抗鼠抗人HLA- E单克隆抗体由美国Abcam公司提供，山羊抗鼠二抗试剂盒和柠檬酸缓冲液(pH=6.0)由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，其他的试验材料由本院药理实验室提供。石蜡切片机和Leica DM4000B显微镜由德国Leica公司提供；烤片机由湖北诺普电子科技有限责任公司提供。

1.3 标本采集与处理 选取上述研究病例的宫颈组织标本，使用中性甲醛和10%酒精固定，常规脱水，石蜡包埋。将每个组织标本制作6张连续切片，将上述石蜡切片依次进行脱蜡和水化处理后，使用高压锅进行抗原修复；柠檬酸盐缓冲液中冷却2 h，依次用蒸馏水洗两遍，磷酸盐缓冲液(PBS)洗一遍。使用含1%胎牛血清的PBS稀释的一抗(1∶50)对切片先在室温下孵育60 min，后于4℃冰箱继续过夜孵育。(鼠抗人HLA- E抗体由EXBIO公司提供，产品克隆号为MEM- E/02，规格为0.1 mg)。次日，将上述过夜孵育的切片用PBS洗涤5 min×3次，于室温下用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗孵育30 min。使用二氨基联苯胺(DAB)进行显色，10 min后使用去离子水冲洗以终止反应，再用苏木素复染后封片观察。每组切片制作和观察过程中均使用PBS缓冲液代替一抗设立3个阴性对照，并将各切片中的血管内皮细胞设立为阳性对照。

1.4 结果判定标准 阳性反应：若阴性对照无特异性着色，而被检测标本细胞膜和细胞质出现棕色颗粒状物则为HLA- E蛋白表达阳性。使用显微镜对上述切片在随机选择的6个高倍镜视野下进行观察并记录染色结果，使用软件Image- Pro Plus 5.0测定每个视野下的累积光密度值(IOD)，将每个切片在6个视野下测定的平均IOD值(IOD/area)作为该切片HLA- E蛋白的相对表达水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 HLA- E表达水平的比较 免疫组织化学检测结果显示，免疫染色主要集中在宫颈腺癌和鳞癌细胞、淋巴细胞以及血管内皮细胞的细胞质及细胞膜中，在细胞核内的表达则几乎未见。而正常鳞状上皮和柱状上皮染色很浅，间质及肌层内几乎未染色。HLA- E在宫颈鳞癌中的表达主要出现在癌细胞和血管内皮细胞的胞膜和胞质中；HLA- E在宫颈腺癌组织中的表达同样主要集中于癌细胞的胞膜和胞质，且表达强度较鳞癌组织更强；HLA- E在正常宫颈组织中的表达较弱。宫颈鳞癌、宫颈腺癌、癌旁组织的平均IOD值分别为(0.111±0.012)、(0.115±0.023)和(0.023±0.061)，宫颈鳞癌、宫颈腺癌分别与癌旁组织比较差异均有统计学意义(t=1.843，6.532，P<0.01)；宫颈鳞癌与宫颈腺癌比较差异有统计学意义(t=0.354，P>0.05)。见图1。

2.2 HLA- E的表达与患者临床病理资料的关系 见表1。

图1 HLA- E在宫颈鳞癌、腺癌及正常宫颈组织中的表达(DAB，×200)

病理特征n宫颈鳞癌(n=60)t值P值n宫颈腺癌(n=32)t值P值分化程度中高分化350.121±0.012-1.9810.052180.118±0.026-0.6800.501低分化250.109±0.033140.112±0.023FIGO分期Ⅰ期330.097±0.0216.7010.000170.123±0.033-2.2160.034Ⅱ期270.132±0.019150.102±0.027肿瘤直径(cm)≥4230.146±0.039-9.8820.000200.114±0.0670.0710.944<4370.079±0.011120.116±0.091浸润深度(mm)≤15310.110±0.0280.3810.705180.120±0.026-2.4960.018>15290.113±0.033140.101±0.013淋巴转移是240.109±0.0190.2520.802120.116±0.052-0.1240.902否360.112±0.056200.114±0.039

颈鳞癌组织HLA- E的表达与患者的FIGO分期及肿瘤直径有关系(P<0.05)，而其他因素之间无显著差异(P>0.05)；宫颈腺癌组织HLA- E的表达与患者的FIGO分期及浸润深度有关系(P<0.05)，而除此之外的其他因素之间无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

宫颈癌威胁全球女性恶性肿瘤患者的生命安全，并且该病全球每年约有52万新增病例，每年死于该病的人数约27万〔5〕。其中，每年约有30%的新发病例和死亡病例发生于我国。与宫颈鳞癌相比，宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌的预后更差，存活率更低，而复发率则更高，对相似的治疗方法的疗效也不一致〔6〕，因此寻求有效的治疗和诊断方案势在必行。HLA- E在病毒感染、器官移植、肿瘤的发生发展以及自身免疫性疾病中均发挥着重要的作用〔7〕。首次对于HLA- E功能较大规模的研究集中在妊娠过程中母胎交互作用，该研究显示，HLA- E能在胎盘组织中表达，并能使母体的免疫系统接纳胎儿，否则胎儿将会被视为异物而被排斥，从而在妊娠过程中发挥着重大的作用〔8〕。在生理情况下，HLA- E与抑制型受体CD94/NKG2A的亲和力较其与激活型受体CD94/NKG2C之间的亲和力明显增加，从而有助于使靶细胞免除NK细胞的杀伤作用〔9〕。而HLA- E在非正常组织的细胞膜表面表达并被CTLs和NKs识别后，可引起细胞活性激活或抑制，至于会引起何种反应，则取决于与之结合的受体的具体类型〔10〕，比如，与CD94/NKG2A受体结合会引起细胞活性抑制反应，而与CD94/NKG2C受体结合则会引起细胞激活反应，因此推断宫颈癌中HLA- E蛋白的表达与临床病理特征存在密切联系〔11〕。

研究结果显示，HLA- E蛋白在宫颈鳞癌和宫颈腺癌组织中高度表达，明显高于癌旁正常组织，提示HLA- E蛋白参与了宫颈癌的发生于发展阶段，HLA- E的作用机制可能是通过启动CD8+T细胞下游信号来抑制相应的免疫细胞的活化，肿瘤细胞躲避免疫系统的攻击〔12〕。另外，在对HLA- E蛋白与临床病理资料之间的联系研究时发现，宫颈癌组织中HLA- E的表达水平随着患者的FIGO分期的发展而升高，同时随着肿瘤直径和浸润深度的增加，HLA- E的表达水平升高，说明HLA- E的表达水平可以在一定程度上反映宫颈癌患者病情的发展状态，用于临床上监测宫颈癌的标志物。推测HLA- E在不同的临床参数之间出现的差异原因可能是不同的HLA- E单克隆抗体，检测的敏感性和特异性不同，或者是由于样本量有限，导致其出现差异，此外，还可能是由于不同类型肿瘤的生物学行为不同〔13〕。

本研究结果提示，HLA- E在老年宫颈癌组织中高度表达，尤其是宫颈腺癌组织中，并且与宫颈癌的FIGO分期、肿瘤直径和浸润深度之间存在密切联系，提示其可以作为临床上诊断宫颈癌的标志物之一。

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〔2017- 04- 09修回〕

(编辑 袁左鸣)

付俊生(1966- )，男，主任医师，主要从事妇科肿瘤研究。

江恩利(1980- )，女，硕士，主治医师，主要从事妇科肿瘤研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3779- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.061