宿世震 项东宇 刘 杰 王金凤

(山东中医药高等专科学校，山东 烟台 264199)

桑枝黄酮对糖尿病肾病大鼠的保护作用

宿世震 项东宇 刘 杰 王金凤

(山东中医药高等专科学校，山东 烟台 264199)

目的 观察桑枝黄酮对糖尿病肾病(DN)大鼠的保护作用。方法 采取一侧结扎肾脏+链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法复制DN大鼠模型，分为模型组，二甲双胍组、低、高剂量桑枝黄酮组(9、18 g/kg)，取健康大鼠为正常对照组，灌胃治疗，1次/d，连续4 w后检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、肿瘤坏死因子(TNF)- α、白细胞介素(IL)- 6和C反应蛋白(CRP)水平；收集24 h尿液测定尿蛋白。同时取肾脏制备病理切片，PAS染色后镜下观察。结果 与正常对照组比较，模型组的FBG、Scr、尿蛋白、TNF- α、IL- 6、CRP均显著升高(P<0.01)，说明DN模型复制成功；与模型组比较，桑枝黄酮组的FBG、mAlb、TNF- α、IL- 6、CRP水平显著降低(P<0.01)，并呈一定剂量依赖性；病理切片显示高剂量桑枝黄酮组大鼠肾脏损害轻于模型组。结论 桑枝黄酮可降低DN大鼠的血糖、改善肾功能、减轻肾脏病理改变，对DN大鼠的肾脏具有保护作用，降低炎症因子水平可能是其机制之一。

桑枝黄酮；糖尿病肾病；炎症因子

桑枝是桑科植物桑Morus alba L.的干燥嫩枝，性平味微苦，归肝经。桑枝的药理作用在我国很早就有医书记载，如“桑枝，功专去风湿拘挛”、“疗遍体风痒干燥，兼疗口干”等，目前临床多应用于关节肿痛、手足麻木等疾病。实验研究显示桑枝具有降糖、降脂、抗氧化、抗炎等作用〔1～3〕。糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者常见的慢性并发症，近年研究发现炎症因子白细胞介素(IL)- 6、肿瘤坏死因子(TNF)- α和C反应蛋白(CRP)在DN发生发展中起着重要作用，并认为DN是一种炎症性疾病〔4，5〕。本文探讨桑枝黄酮对DN大鼠炎症因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠，SPF级，由山东大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(鲁)20090001，体重192～217 g，雌雄各半，摄食饮水自由，饲料喂普通大鼠饲料，饮水采用高压灭菌自来水。

1.2 药物及试剂 桑枝黄酮制备：桑枝购于本校附属医院，经山东中医药高等专科学校中药鉴定教研室王苏丽教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥嫩枝，桑枝烘干粉碎，以95%乙醇为溶剂，料液比为1∶10，80℃提取3次，合并提取液，减压回收至无醇味，加适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压浓缩，真空干燥，备用。1 g提取物相当于生药75 g，临用前配置为生药浓度0.9 g/ml，复温至25℃～30℃后灌胃。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)。尿微量白蛋白测定试剂盒(广州智真生物科技有限公司，批号20131129)。IL- 6、TNF- α、CRP试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20131225)。二甲双胍(河南天方药业股份有限公司，批号130105112)

1.3 主要仪器 微量血糖仪及试纸(ACCU- Chek Active，德国罗氏诊断公司)；ZD- 420电热恒温水浴箱(杭州蓝天化验仪器厂)；st- 60索氏提取器(上海精密科学仪器总厂)；680酶标仪(美国Bio- rad公司)；CX21BIM- SET6奥林巴斯生物光学显微镜(日本奥林巴斯有限公司)等。

1.4 实验方法及指标检测

1.4.1 模型制备 大鼠70只，适应性喂养1 w后，随机数字表法取10只作为正常对照组，余60只大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥钠进行麻醉后，从左侧脊柱与肋骨相交处稍下方切开皮肤及肌层，暴露肾脏，于肾门处沿肾蒂同时结扎肾脏动静脉和输尿管，缝合肌层和皮肤，术后4 w，禁食12h，腹腔注射1%STZ溶液55 mg/kg，72 h后取尾血测定空腹血糖(FBG)，≥16.6 mmol/L为初选指标，稳定2 w后FBG≥16.6 mmol/L、尿糖强阳性、尿量大于正常对照组的50%为DN模型〔6〕，其中8只大鼠于术中或术后死亡，4只大鼠于注射STZ后死亡，2只大鼠血糖未达标，最终成模46只。

1.4.2 动物分组及给药 成模大鼠按随机数字表法选取40只，随机分为四组，每组10只，即模型组、二甲双胍组(65 mg/kg)、低、高剂量桑枝黄酮组(以生药计，9.0、18.0 g/kg)，以上给药剂量均参考“人与动物体表面积计算药物量”的方法制定，正常对照组及模型组每次给予蒸馏水2 ml，灌胃给药，1次/d，连续4 w。

1.4.3 指标检测 动物禁食不禁水12 h，剪尾取血，应用微量血糖仪检测FBG；腹主动脉取血，EDTA抗凝管收集，离心分离血浆、冻存待测。全自动生化分析仪测定血肌酐(Scr)，酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL- 6、TNF- α、CRP水平，严格按照说明书进行操作；于取血前用代谢笼收集24 h尿液，混匀后取4 ml，免疫透射比浊法测定24 h尿蛋白；病理切片过程为取血后迅速取肾脏，去除肾包膜及肾门结缔组织并用生理盐水洗净，经肾门冠状面取肾组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，PAS染色，光镜下观察肾小管、肾小球结构、基质增生和炎细胞浸润等情况。

1.5 统计学方法 应用SPSS12.0统计软件进行方差分析，两两比较采用SNK法。

2 结 果

2.1 各组大鼠FBG、Scr、尿蛋白的比较 与正常对照组比较，模型组大鼠FBG、Scr、尿蛋白明显升高(P<0.01)，提示模型复制成功；与模型组比较，低、高剂量桑枝黄酮组的FBG、Scr、尿蛋白显著下降(P<0.01)，桑枝黄酮高剂量组作用更明显，见表1。

表1 各组 FBG、Scr、尿蛋白、IL- 6、TNF- α、CRP水平比较

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与低剂量桑枝黄酮组比较：3)P<0.05，与二甲双胍组比较：4)P<0.05

2.2 各组炎症因子IL- 6、TNF- α、CRP比较 与正常对照组比较，模型组IL- 6、TNF- α、CRP水平显著升高(P<0.01)，说明DN大鼠体内炎症水平升高；与模型组比较，桑枝黄酮组IL- 6、TNF- α、CRP水平均不同程度降低，并呈剂量依赖性(P<0.01)，且作用优于二甲双胍组(P<0.05)，见表1。

2.3 各组肾脏组织学比较 正常对照组镜下肾小球基底膜完整，间质中未见炎症细胞浸润、系膜基质未见明显异常改变；模型组镜下可见肾小球体积增大，系膜基质增生，基底膜增厚，肾小管坏死，炎性细胞浸润，呈空泡变性，间质部见糖原积累，髓质亦可见糖原积累，符合DN特征。各给药组大鼠肾脏病理改变较模型组有所减轻，桑枝黄酮高剂量组改变明显，基底膜少量增厚，病变明显减轻，见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织表现(PAS染色，×200)

3 讨 论

炎症因子IL- 6、TNF- α、CRP与DN的发生发展密切相关〔5，7〕。IL- 6主要由脂肪组织、单核- 巨噬细胞分泌，具有多种生物学效应，可通过旁分泌或自分泌形式与肾小球系膜细胞上的IL- 6受体结合，刺激肾小球系膜的增殖和细胞外基质的产生、诱导成纤维细胞的增殖，导致肾小球肥大、肾小球滤过膜增厚、肾间质纤维化及出现蛋白尿等。此外，IL- 6基因的表达与肾间质损伤程度密切相关〔8〕。

TNF- α主要由即使细胞产生，糖尿病时肾小球和肾小管间质其表达增高，TNF- α可促进炎症细胞聚集与黏附，诱发炎症反应，减少血浆纤溶酶原激活物的合成，导致肾小球毛细血管内血栓和纤维素样物质的生成，引起肾小球结构和功能异常继而尿中蛋白排出增加〔9，10〕。CRP是由肝脏产生的一种急性期蛋白，可降低内皮型一氧化氮合酶的表达及生物活性；参与氧化应激，刺激血管内皮释放炎症因子如细胞间黏附分子- 1、TNF- α及单核细胞趋化蛋白- 1等；促进白细胞释放超氧化物歧化酶和蛋白水解酶，从而引起肾损伤，并与尿蛋白排泄率及疾病严重程度相关〔10，11〕。近年来，许多动物实验和临床研究均表明抗炎治疗可以降低尿蛋白排泄率以及延缓肾脏损伤的进程〔12，13〕。

本实验采用一侧肾脏结扎加小剂量STZ腹腔注射的方法复制DN模型，模型复制成功，并证实DN大鼠体内存在着炎症状态，桑枝黄酮对DN模型大鼠的肾脏具有保护功能，考虑其保护肾脏的机制可能与降低IL- 6、TNF- α、CRP等炎症因子水平有关，其抑制炎症的作用及具体机制有待深入研究。

1 吴志平，周巧霞，顾振纶，等.桑树不同药用部位的降血糖效果比较〔J〕.蚕业科学，2005；31(2)：215- 7.

2 刘先明，李 琳，王元净，等.桑枝皮提取物对急性高血脂症小鼠血脂水平的影响〔J〕.蚕业科学，2011；37(4)：771- 4.

3 章丹丹，高月红，Jessica TL，等.桑枝总黄酮的抗氧化活性研究〔J〕.中成药，2011；33(6)：943- 6.

4 韦 丽，刘 春.糖尿病肾病炎症机制的研究与防治进展〔J〕.临床荟萃，2012；27(1)：83- 5.

5 Devaraj S，Dasu MR，Jialal I.Diabetes is a proinflammatory state：a translational perspective〔J〕.Expert Rev Endocrinol Metab，2010；5(1)：19- 28.

6 李世芬，王心如，王玉翠，等.SD大鼠糖尿病肾病模型构建的比较〔J〕.南京医科大学学报(自然科学版)，2010；30(8)：1123- 8.

7 Samaropoulos XF，Light L，Ambrosius WT，etal.The effect of intensive risk factor management in type 2 diabetes on inflammatory biomarkers〔J〕.Diabetes Res Clin Pract，2012；95(3)：389- 98.

8 Mora C，Navarro JF.Inflammation and diabetic nephropathy〔J〕.Curr Diab Rep，2006；6(6)：463- 8.

9 Khajehdehi P，Pakfetrat M，Javidnia K，etal.Oral supplementation of turmeric attenuates proteinuria，transforming growth factor- β and interleukin- 8 levels in patients with overt type 2 diabetic nephropathy：a randomized，double- blind and placebo- controlled study〔J〕.Scand J Urol Nephrol，2011；45(5)：365- 70.

10 武晓慧，黄颂敏.糖尿病肾病与炎症致病作用及治疗研究进展〔J〕.华西医学，2010；25(6)：1198- 201.

11 Abrahamian H，Endler G，Exner M，etal.Association of low- grade inflammation with nephropathy in type 2 diabetic patients：role of elevated CRP- levels and 2 different gene- polymorphisms of proinflammatory cytokines〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2007；115(1)：38- 41.

12 田 华，张松峰，尤丽菊，等.姜黄素对糖尿病肾病大鼠肾脏炎症损伤的保护作用〔J〕.细胞与分子免疫学杂志，2013；29(11)：1166- 8.

13 张江华，陈志强，赵 雯，等.益气养阴消牴通络中药对早期糖尿病大鼠肾组织 Podocin 基因表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(6)：3044- 6.

〔2016- 02- 28修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

山东省中医药科技发展计划项目(No.2009- 271)

宿世震(1979- )，男，讲师，在读硕士，主要从事动物模型及解剖学研究。

R965

A

1005- 9202(2017)15- 3697- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.024