崔 丹

(白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000)

外源性骨形态发生蛋白9转入肺鳞癌细胞对其活性的影响及作用机制

崔 丹

(白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000)

目的 观察骨形态发生蛋白(BMP)9对人肺鳞癌细胞株YTMLC- 90迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法 RT- PCR和Western印迹法检测YTMLC- 90细胞和正常人支气管上皮细胞(NHBE)中BMP9 mRNA和蛋白表达水平；以转染重组腺病毒Ad- BMP9的YTMLC- 90细胞为研究组，转染Ad- GFP为阴性对照组，未转染为空白对照组；采用划痕愈合实验检测3组细胞迁移能力，Transwell实验检测迁移和侵袭能力，同时检测迁移相关因子基质金属蛋白酶(MMP)2 mRNA和蛋白表达情况；Western印迹法检测3组细胞BMP- Smad信号通路中Smad 1/5磷酸化水平。结果 YTMLC- 90细胞中BMP9 mRNA和蛋白表达量均明显低于NHBE细胞(P<0.05)。Ad- BMP9转染YTMLC- 90细胞后胞内BMP9蛋白表达量明显高于阴性对照组(P<0.01)。空白对照组48 h的细胞划痕愈合率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；研究组细胞划痕愈合率明显低于阴性对照组和空白对照组，穿过小室膜和基质胶的YTMLC- 90细胞数均明显少于阴性对照组和空白对照组，MMP2表达量明显低于阴性对照组，MMP2 mRNA和蛋白表达量均明显低于阴性对照组(均P<0.05)。YTMLC- 90细胞高表达BMP9后其p- Smad 1/5表达量明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。结论 外源性BMP9转入人肺鳞癌细胞株YTMLC- 90可有效抑制其迁移和侵袭能力，激活BMP- Smad信号通路是该抑制作用的机制之一。

骨形态发性蛋白；肺鳞癌细胞；BMP- Smad通路

肺癌多发于中老年人，其中非小细胞肺癌(包括肺鳞癌、腺癌)约占肺癌总数的80%〔1〕。我国近5年肺鳞癌发病率成倍增长，而转移和侵袭是导致非小细胞肺癌患者不良预后和死亡的主要原因〔2〕。骨形态发生蛋白(BMP)对体内组织脏器间平衡状态的维持具有重要的生物学作用，关于BMPs家族与肿瘤发生关系的研究近年来逐渐增多，其中以BMP2～7 最常见〔3〕。BMP9发现较晚且研究较少，其在肺癌中的调控作用还鲜有研究报道。本研究使用重组腺病毒Ad- BMP9转染过表达的BMP9，分析BMP9对人肺鳞癌细胞株YTMLC- 90迁移和侵袭能力的影响及其生物学机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人肺鳞癌细胞株YTMLC- 90、人胚肾细胞株 ATCC、正常人支气管上皮细胞(NHBE)、重组腺病毒均购于通派(上海)生物科技有限公司；DMEM培养基、RPMI- 1640培养基、胎牛血清购于上海碧云天生物技术有限公司；Trizol、逆转录试剂盒购于美国Invitrogen公司；Transwell小室购于北京乐博生物科技有限公司；抗BMP9抗体、抗基质金属蛋白酶(MMP)2抗体购于上海恒斐生物科技有限公司；抗Smad1/5/8抗体、抗p- Smad1/5抗体购于上海远慕生物科技有限公司；羊抗兔IgG/HRP标记的二抗、羊抗鼠IgG/HRP标记的二抗购于北京基尼亚生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及病毒感染 将重组腺病毒(Ad- GFP、Ad- BMP9)分别接种于人胚肾细胞株 ATCC，用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养。用含10%胎牛血清的RPMI- 1640培养基常规培养人肺鳞癌细胞株YTMLC- 90，用扩增的腺病毒感染YTMLC- 90细胞，置于CO2细胞培养箱中孵育，其中转染Ad- BMP9的为研究组，转染Ad- GFP的为阴性对照组，未转染重组腺病毒的为空白对照组。

1.2.2 划痕愈合实验 以5×105/孔的密度将YTMLC- 90细胞接种于6孔板，当细胞愈合率≥80%时，加入凝聚胺和重组腺病毒，4 h后用无菌牙签在细胞愈合表面轻划一条直线划痕，磷酸 盐缓冲液(PBS)洗净后加入空白RPMI- 1640培养基，显微镜下观察和拍照，记为0 h；在CO2细胞培养箱中继续孵育48 h后在观察划痕处细胞愈合情况并拍照，计算每组细胞的划痕愈合率。

1.2.3 Transwell细胞迁移和侵袭实验 将腺病毒感染48 h的YTMLC- 90细胞用无血清培养基重悬，在上室(基质胶与无血清的RPMI- 1640培养基按1∶3比例，铺100 μl)中加入200 μl含5×108个细胞的悬液，在下室中加入500 μl含10%胎牛血清的RPMI- 1640培养基，孵育24 h后用无菌棉签擦去上室中的基质胶和残余细胞，结晶紫染色后在光学显微镜下选取5个视野计数并拍照。

1.2.4 RT- PCR检测 取腺病毒感染48 h的YTMLC- 90细胞和未感染的细胞，用Trizol试剂盒提取每组细胞总RNA，两步法逆转录得到cDNA并进行PCR扩增，反应体系为20 μl，引物由上海卓康生物科技有限公司合成。常规反应条件下进行40个循环。用Quantity one软件检测结果的灰度值，计算BMP9、MMP2、Noggin的相对表达量。

1.2.5 Western印迹检测 取腺病毒感染48 h的YTMLC- 90细胞并提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取100 μg蛋白样本用SDS- 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白、湿法转膜，BSA封闭后加一抗(稀释比例为BMP9：1/500，Smad1/5/8：1/1 000，p- Smad1/5∶1/1 000)，4℃孵育过夜，洗膜后加二抗(1/5 000)，37℃孵育60 min后ECL显影，用Quantity one软件检测电泳条带的灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 BMP9在人肺鳞癌细胞株YTMLC- 90和NHBE中的表达 人肺鳞癌细胞株YTMLC- 90中BMP9 mRNA表达量(0.51±0.19)明显低于NHBE(0.69±0.05)(P<0.05)；肺鳞癌细胞株YTMLC- 90中BMP9 蛋白表达量(1.38±0.20)明显低于NHBE(2.06±0.31)(P<0.05)。见图1。

图1 YTMLC- 90和NHBE中BMP9 蛋白表达

2.2 重组腺病毒转染YTMLC- 90细胞对BMP9表达的影响 分别用重组腺病毒Ad- GFP、Ad- BMP9转染YTMLC- 90细胞，常规培养48 h后感染率≥80%。Ad- BMP9转染YTMLC- 90细胞后，胞内BMP9蛋白表达量(5.91±1.30)明显高于阴性对照组(2.05±0.61，P<0.01)，提示BMP9在YTMLC- 90细胞中成功高表达。

2.3 高表达BMP9对YTMLC- 90细胞活性和MMP2表达水平的影响 空白对照组48 h的细胞划痕愈合率为(65.19±5.56)%，与阴性对照组〔(60.12±4.47)%〕比较差异无统计学意义(P>0.05)；研究组细胞划痕愈合率〔(24.38±3.51)%〕明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)，见图2。研究组穿过小室膜的YTMLC- 90细胞数明显少于阴性对照组和空白对照组，穿过基质胶的YTMLC- 90细胞数明显少于阴性对照组和空白对照组，见图3、图4。研究组MMP2 mRNA表达量(0.48±0.13)明显低于阴性对照组(0.65±0.18)(P<0.05)，MMP2蛋白表达量(0.63±0.11)明显低于阴性对照组(0.85±0.21，P<0.05)。

2.4 高表达BMP9对YTMLC- 90细胞中BMP- Smad信号通路的影响 YTMLC- 90细胞高表达BMP9后，p- Smad 1/5的表达量(0.96±0.14)明显高于阴性对照组(0.44±0.03)和空白对照组(0.41±0.08，P<0.01)。见图5。

图2 3组细胞划痕愈合实验结果(×100)

图3 Transwell实验穿过小室膜的细胞数量(×100)

图4 Transwell侵袭实验穿过基质胶的细胞数量(×100)

图5 各组p- Smad1/5的表达情况

3 讨 论

相关研究发现，早期肺癌发生与多种基因的表达相关，而BMPs家族在肿瘤病情进展中发挥重要作用〔4〕；动物实验显示，BMP2表达量增加会提升肺癌的发生率和死亡率，可刺激肺癌细胞体外迁移和侵袭〔5〕。此外，BMP6和BMP3在肺癌组织中蛋白表达水平明显高于正常组织〔6〕。BMP9在不同类型肿瘤中作用存在差异，在前列腺癌组织和细胞中检出BMP9低表达，调高BMP9表达水平后可明显抑制前列腺癌细胞增殖和侵袭力〔7〕；但在肝癌组织中存在BMP9高表达，使用病毒载体抑制其表达后可明显减弱肝癌细胞的迁移和侵袭能力〔8〕；说明BMP9在前列腺癌中发挥抑癌基因的作用而在肝癌中是促进癌细胞病变的因子。

本次研究显示，BMP9在人肺鳞癌细胞株YTMLC- 90中的表达水平明显低于正常支气管上皮细胞。使用重组腺病毒Ad- BMP9转染YTMLC- 90细胞后胞内过表达BMP9，细胞的迁移能力和侵袭能力均明显降低。BMP- Smad信号通路是BMPs家族发挥调控作用的经典通路，高表达BMP9的YTMLC- 90细胞中BMP- Smad信号通路中Smad1/5磷酸化明显增强，提示BMP9通过BMP- Smad信号通路调控肺癌细胞增殖、转移等生物学活性。

综上所述，高表达BMP9可有效抑制人肺鳞癌细胞株YTMLC- 90的迁移、侵袭能力，主要通过激活BMP- Smad信号通路发挥调控作用，因此BMP9有望成为治疗肺癌的一个新靶点。对于BMP9是否能通过激活Erk、P38 Mark 等其他信号通路来调控肺癌细胞增殖和迁移仍需进一步研究。

1 余 虹,邱昕光.老年综合评价体系对老年非小细胞肺癌患者个体化治疗的指导意义〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(2):387- 9.

2 徐维国.CXCL12- G801A基因多态性与我国汉族人群非小细胞肺癌发病风险的相关性研究〔D〕.广州：南方医科大学,2015.

3 Choi YJ,Kim ST,Park KH，etal.The serum bone morphogenetic protein- 2 level in non- small- cell lung cancer patients〔J〕.Med Oncol,2012;29(2):582- 8.

4 郑宏瑜.非小细胞肺癌组织中BMP- 2与CD105的表达和意义〔D〕.南昌：南昌大学,2011.

5 Owens P,Pickup MW,Novitskiy SV,etal.Inhibition of BMP signaling suppresses metastasis in mammary cancer〔J〕.Oncogene,2015;34(19):2437- 49.

6 Yeh LC.In vitro and in vivo studies on the effects of bone morphogenetic protein- 7 on human kidney and lung tumor cells〔J〕.Int J Biomed Sci,2010;6(3):176- 81.

7 Lee KB,Murray SS,Duarte MEetal.Effects of the bone morphogenetic protein binding protein spp24(secreted phosphoprotein 24 kD) on the growth of human lung cancer cells〔J〕.J Orthop Res,2011；29(11):1712- 8.

8 Ye L,Mason MD,Jiang WG,etal.Bone morphogenetic protein and bone metastasis,implication and therapeutic potential〔J〕.Front Biosci(Landmark Ed),2011;16:865- 97.

〔2016- 10- 18修回〕

(编辑 滕欣航)

崔 丹(1978- )，女，讲师，主要从事生理学研究。

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A

1005- 9202(2017)15- 3691- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.021