周夏娟 应旭旻

(浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006)

Ⅱ型胶原蛋白与弗氏佐剂诱导关节炎小鼠模型的建立

周夏娟 应旭旻1

(浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006)

目的 探讨成功建立胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型及如何提高建模成功率。方法 选择8周龄的雄性DBA/1J小鼠20只，随机分为正常组(n=10),CIA实验组(n=10)，100 μg牛Ⅱ型胶原蛋白溶于完全弗氏佐剂，在尾根部皮下注射，第21天再次注射50～100 μg。免疫后观察小鼠的关节改变，按小鼠关节疾病严重程度评分。结果 正常组均未发病，实验组约4 w后开始第一个足趾出现肿胀，第7周发病率为50%，平均关节炎指数(MAI)为2.1，10 w后CIA小鼠模型的发病率为90%，MAI为7.1。结论 选择近交系雄性的DBA/1J小鼠，且选择小鼠尾根部皮下注射Ⅱ型胶原蛋白与弗氏佐剂相对发病率较高。

DBA/1J ；关节炎；Ⅱ型胶原蛋白

胶原诱导关节炎(CIA)模型是一种由胶原诱导的免疫炎症模型,为多发性关节炎,在动物模型中表现的红肿热痛的病理表现和发病机制与人类风湿关节炎(RA)类似。1980年Courtenay等〔1〕建立了小鼠CIA 模型,极大地推进了RA发病机制和治疗的研究。目前对RA的研究热点在于免疫抑制方面发病过程中免疫细胞的相互作用和明确各个细胞分子或酶类在各个免疫环节中的精确作用。因此选择具备合适易感性的品系、建立稳定的CIA模型对研究RA的研究具有重要意义，本实验选用H- 2q单倍型的易感性最高的DBA/1J小鼠，应用Ⅱ型胶原与弗氏佐剂混合诱导的方法，探讨建立高效稳定CIA小鼠模型的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 近交系DBA/1J小鼠20只，雄性,8周龄，由上海斯莱克实验动物中心提供，浙江中医药大学动物中心SPF级别饲养。随机分配为正常组和实验组各10例。

1.2 主要试剂与器材 牛Ⅱ型胶原蛋白、完全弗氏佐剂购自美国Chondrex公司；冰醋酸(杭州红十字会医院中心实验室提供)；制冰机，5 ml空针；橡皮管。

1.3 方法

1.3.1 模型建立方法 牛Ⅱ型胶原蛋白溶于冰醋酸中，浓度为2 mg/ml，放置4℃冰箱中隔夜，等体积与完全弗氏佐剂混合。将2个5 ml的空针拔掉枕头，两针管间用橡皮管连接，将混合液在2个空针间反复来回推动充分乳化。将乳化好的试剂在2 h以内免疫小鼠，在尾根部皮下注射胶原100 μg/只。第21天后再次注射免疫50～100 μg/只，避免重复第一次注射部位。

1.3.2 观察指标 适应性饲养后，每两天观察并记录各小鼠足趾情况及体重变化，每周汇总并分析，持续14 w，其中12 w后实验组小鼠死亡1只，实验结束时，实验组9只，正常组10只。

1.3.3 疾病发病和关节病变的评分 关节炎分数(AS)：为每只小鼠所有病变关节分数的总和,最高分为16 分。各剂量组所有小鼠AS总和除以该组小鼠的只数,即为该组平均关节炎指数(MAI)。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行t检验。

2 结 果

正常组为无发病小鼠。实验组诱导4 w后开始首只小鼠足趾出现红肿，第69天到达高峰。其肿胀多在趾间关节开始，随后肿胀至足垫，踝关节，肿胀后可发展为关节僵硬、畸形，前后趾发病前后不一，前趾的发病率为70%，后趾的发病率为80%。小鼠足趾肿胀程度见图1。第7周实验组发病率为50%，MAI为2.1；10 w后实验组发病率为90%，MAI为7.1。实验组小鼠免疫10 w肿胀程度达峰值，且10 w后肿胀程度稍有减少，但仍维持在较高水平。免疫100 d后，实验组小鼠体重均值〔(24.36±1.37)g〕,明显低于正常组〔(27.25±1.38)g，t=4.701，P<0.05〕，表明胶原免疫致病对小鼠的体重变化有影响。

图1 DBA/1J小鼠关节病变

3 讨 论

根据文献报道目前常用的RA动物模型有佐剂性关节炎(AA)模型、CIA模型和人鼠嵌合模型〔2，3〕，但人鼠嵌合模型虽然在机制方面有明显优势，但受伦理、法制等约束故临床不常用，故本研究选择更接近RA发病机制的CIA模型。本文结果显示牛Ⅱ型胶原蛋白免疫的DBA/1J小鼠发病率高可达90%以上，且MAI和发病严重程度均较高，能够为RA的发病机制和病理特征的研究提供稳定的动物模型基础。目前国内外很多文献研究实验大鼠作为动物模型，大鼠的CIA模型动物品系有DA大鼠、SD和Wistar远交群大鼠、近交系Lewis大鼠，其中DA大鼠主要由国外引进，价格昂贵、适应力差、免疫力低下，不易哺育等特点限制了其实际应用；远交群SD和Wistar大鼠价格便宜、适应力强，繁殖快等特点为国内研究建造CIA模型高频率应用；近交系Lewis大鼠因购买方便，价格合理是国内使用率相对较高的品系〔4〕。小鼠CIA敏感性和老鼠的组织相容性复合体(MHC)相关，因此只有选择易感性强的H- 2q或H- 2r单倍型的小鼠如：DBA/1 (H- 2q) B10.RIII (H- 2r)和易感性稍弱的C57BL/6小鼠。在大鼠中对CIA的敏感性也与组织相容性复合体相关，但与小鼠相比较具有比较宽的范围，因此本实验选择小鼠作为动物模型。目前小鼠CIA模型的品系大致分为两种易感性强的DBA/1 (H- 2q)或B10.RIII (H- 2r)和易感性较弱的C57BL/6(H- 2b)小鼠，对有文献报道C57BL/6小鼠CIA模型的发病率最高为70%〔5〕,明显低于DBA/1J品系的小鼠(发病率90%～100%)。不同品系的小鼠对不同种类的Ⅱ型胶原蛋白的敏感度是不同的，如B10.RIII小鼠对牛型、猪型的Ⅱ型胶原蛋白敏感，但是对鸡型和人型的Ⅱ型胶原蛋白无反应。DBA/1J小鼠对鸡型、牛型、猪型、人型都具有高敏性，故本实验选择牛Ⅱ型胶原蛋白。试剂在乳化过程的充分性也至关重要，本实验用橡皮管连接的两个空针作为乳化的工具，将等体积溶于完全弗氏佐剂中的胶原蛋白在冰浴环境中来回推动乳化，乳化时间至少2～3 h才能将其充分乳化。但此种乳化耗时久，过程中试剂耗损大，推荐使用匀浆器充分乳化。

1 Courtenay JS,Dallman MJ,Dayan AD,etal.Immunisation against heterologous type Ⅱ collagen induces arthritis in mice〔J〕.Nature,1980;283(5438):666- 8.

2 张 巍,王 芳,王 博,等.佐剂诱导关节炎大鼠模型的建立及成纤维样滑膜细胞的分离〔J〕.中国动物实验学报,2012;20(6):73- 7.

3 孙佳蕾,武 平,陈白露,等.类风湿关节炎动物模型在中医研究中的应用〔J〕.现代中西医结合杂志,2015;24(4):444- 7.

4 赵宏艳,王 燕,肖 诚,等.不同品系、不同性别对大鼠CIA发病情况的比较研究〔J〕.中国中医基础学杂志,2010;16(9):761- 4.

5 贾俊峰,李晓燕,朱 平,等.C57BL/ 6小鼠CIA模型的建立及其监测体系的初步筛选〔J〕.解放军医学杂志,2004;29(6):472- 4.

〔2016- 01- 13修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

杭州市科技局项目(No.20110733Q15)

应旭旻(1972- )，男，博士，主任中医师，硕士生导师，主要从事肾脏病学研究。

周夏娟(1988- )，女，硕士，住院医师，主要从事中医药防治肾脏疾病研究。

R392

A

1005- 9202(2017)15- 3689- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.020

1 杭州市急救中心