陶英歌 付高洁 国向东 刘 磊

(牡丹江医学院第二附属医院消化内科，黑龙江 牡丹江 157000)

前列腺素E2激活YAP正反馈回路促进小鼠结肠炎后结肠再生及癌变的分子机制

陶英歌 付高洁 国向东 刘 磊

(牡丹江医学院第二附属医院消化内科，黑龙江 牡丹江 157000)

目的 研究前列腺素(PGE2)激活Yes信号通路相关蛋白(YAP)正反馈回路促进小鼠结肠炎后结肠再生及癌变的分子机制。方法 将DLD1结肠癌细胞株或基因稳定敲除细胞株，在有/无信号通路特异性抑制剂的条件下，采用重组PGE2或PBS孵育，采用免疫印迹法、免疫荧光法、定量PCR、转录和增殖法进行比较分析。采用DSS法诱导C57/BL6小鼠结肠炎模型(对照鼠)，同时构建羟基前列腺素脱氢酶基因敲除鼠(15- PGFH- KO)、YAP基因敲除鼠(YAP- KO)、和双基因敲除(DKO)小鼠，采用吲哚美辛抑制PGE2合成信号通路，检测下游基因表达及结肠再生和癌变功能。结果 PGE2处理结肠癌细胞株导致YAP mRNA转录及蛋白表达水平升高，15- PGDH- KO组鼠结肠组织中PGE2的表达水平较对照敲除细胞(WT)组增长了2.5倍，吲哚美辛处理后15- PGDH- KO组鼠YAP的表达水平及下游靶基因水平均较WT鼠显著升高。吲哚美辛处理显著降低PG过氧化物合成酶(COX)- 2及PGE受体4基因(EP4)的转录水平，转染YAP持续激活突变体(5SA)可显著增加 COX- 2和EP4的蛋白表达水平和转录水平，敲除YAP后上述现象消失。对照鼠口服葡聚糖硫酸钠(DSS)导致结肠炎，注射PGE2促进小鼠发生结肠再生；YAP敲除鼠并未发生结肠再生，同时口服DSS后迅速死亡；15- PGFH敲除鼠结肠组织再生比对照鼠更快，且体重恢复更快、结肠长度和结肠炎组织学得分更高。上述现象可以被注射吲哚美辛逆转。YAP敲除鼠或15- PGFH敲除鼠诱导结肠炎后未发现自发性肿瘤，YAP/15- PGDH双基因敲除鼠出现息肉并最终发展成原位癌。口服吲哚美辛可有效防止双敲除鼠自发性肿瘤的形成。结论 PGE2可增加YAP的表达水平和转录活性，从而促进 COX- 2及EP4的表达水平增加，这一信号回路可促进扩散的结肠癌细胞系增殖和结肠炎小鼠结肠组织再生，持续性激活进一步可导致息肉和小鼠结肠肿瘤的形成。

前列腺素E2；信号通路；结肠炎；结肠再生；肿瘤形成

结肠癌(CRC)全球发病率极高，尤其老年CRC患者往往难以耐受化疗不良反应〔1〕。目前研究表明，前列腺素(PG)E2和Yes信号通路相关蛋白(YAP)信号通路与CRC形成高度相关，而PGE2通过环氧合酶(COX)- 2合成，成为机体组织再生的重要炎性介质〔2〕，但其持续的激活已与癌变有关〔3〕，但这一信号通路如何促进肿瘤新生及其下游效应物尚未研究清楚，对这一信号通路的深入研究有助于结肠癌的预防和治疗，延长老年患者的生存期，提高其生活质量。研究表明，YAP可参与组织再生的调节，与PGE2表型高度类似，因此两者之间是否存在相互作用也亟待研究〔4〕。本研究通过分子生物学和药理学研究，阐明PGE2和YAP的相互作用对小鼠结肠炎后结肠再生及癌变的分子机制的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 DLD1结肠癌细胞株采用含10%FBS的DMEM(Gibco)培养基培养，细胞长至70%～80%时加入药物处理。PGE2，CAY10598，葡聚糖硫酸钠(DSS)，GW627368X和AZD6244(Selumetinib)购自Pierce，FR- 180204购自Selleck，LY294002，IKK16和维替泊芬(Verteporfin)购自Sigma Aldrich。6～8周龄SPF级C57BL/6小鼠购自黑龙江省实验动物中心，合格证SYXK(黑)2016- 0014。

1.2 基因敲除细胞株(小鼠)的构建 将15- PGDH、YAP(5SA)、YAP(5SA- S94A基因克隆进pMSCV- puro载体中，同时将YAP shRNA cDNA构建到pSuperRetro- puro载体中，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染至293T细胞培养24 h后收取病毒上清，用于感染DLD- 1结肠癌细胞，并采用嘌呤霉素(5 μg/ml)筛选稳定细胞株，同时采用随机序列对照敲除质粒Vector shRNA构建对照敲除细胞株(WT细胞)。

羟基前列腺素脱氢酶基因敲除鼠(15- PGFH敲除鼠)、YAP基因敲除鼠(YAP敲除鼠)、双基因敲除鼠(DKO)及对照敲除鼠(WT鼠)的构建由吉玛公司制备并验证。正常培养上述小鼠1年，并观察是否存在息肉、自发肿瘤的发生。

1.3 免疫荧光法 取对数生长期的人结肠癌细胞系DLD- 1细胞，接种于24孔板中，分为两组，实验组采用PGE2处理，对照组采用磷酸盐缓冲液(PBS)处理，各组细胞处理8 h后，采用4%多聚甲醛溶液室温固定30 min，PBS清洗3次；然后用0.5% TritonX- 100破膜10 min，加入山羊血清室温封闭1 h；加入1∶500稀释鼠抗人YAP多克隆抗体，4℃孵育过夜；再加入1∶100稀释的山羊抗鼠荧光二抗4℃避光孵育30 min；经DAPI染色洗涤后，用莱卡台式激光共聚焦荧光显微镜观察结果。

1.4 CCK- 8检测细胞增殖 取对数生长期的人结肠癌细胞系DLD- 1细胞，接种于96孔板中，分为两组，实验组采用PGE2处理，对照组采用PBS处理，各组细胞处理8 h后，每孔加入100 μl CCK- 8，37℃继续孵育2 h，用Bio- Red多功能酶标仪测定450 nm处各孔的D值，比较细胞增殖情况。

1.5 DSS诱导小鼠结肠炎模型 取30只C57/BL6小鼠，自由饮用无菌水溶解的5% DSS，每24 h更换一次，培养7 d，第8天评价结肠炎造模情况，并给药处理小鼠。造模后每天观察小鼠毛色变化、活动情况、大便性状及出血等情况。

1.6 DSS诱导结肠炎组织学评价 取小鼠结肠并沿肠系膜纵轴缘剪开肠腔，生理盐水冲洗后取炎症最明显处长约1 cm的组织，10%中性甲醛固定后石蜡包埋切片。结肠炎的组织学评价采用苏木精- 伊红的组织切片染色，测定溃疡和糜烂的数量和面积。黏膜隐窝损伤的程度(隐窝炎评分从0～4分：0级，无损伤；1级，1/3的基底层损伤；2级，基底层2/3的损伤；隐窝受损且暴露上皮层表面；4级，整个隐窝受损且表面上皮层全部暴露。对样本同时测量相同区域，并根据其损伤程度从0～4级评分，最终得分通过损伤分级乘以整个结肠隐窝损伤面积得到。

1.7 qPCR分析转录情况 使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从培养的细胞和结肠组织中分离总RNA，取1～2 μg用Gene Amp RNA PCR Core Kit(Applied Biosystems)进行逆转录，使用2倍SYBR Green Pre- mix(Elpisbio)在7500 Fast Real- Time PCR machine(Applied Biosystems)定量PCR仪上进行qPCR分析。靶基因的Ct值通过β- actin或GAPDH进行均一化。qPCR引物序列如下：β- actin：5′- TCCTGTGGCATCCACGAAACT- 3′，5′- GAAGCATTTGCGGTGGACGAT- 3′；GAPDH:5′- ATCCTGCACCACCAACTGCT- 3，5′- GGGCCATCCACAGTCTTCTG- 3;YAP:5′- TGGGAGATGGCAAAGACATCTTCTG- 3′,5′- ACACTGGATTTTGAGTCCCACCATC- 3′;COX- 2:5′- GAATCATTCACCAGGCAAATTG- 3′,5′- TCTGTACTGCGGGTGGAACA- 3′;EP4:5′- GACCTGTTGGGCACTTTGTT- 3,5′- AGGTAGCGCTCGACACTCAT- 3′;CTGF:5′- AAAAGTGCATCCGTACTCCCA- 3′,5′- CCGTCGGTACATACTCCACAG- 3′。

1.8 免疫印迹检测 SDS- PAGE胶的配制和电泳检测细胞(组织)中提取蛋白及电泳、PAGE胶转印、封闭、一抗孵育、二抗孵育及曝光后，采用Image J对胶片灰度进行定量分析。

1.9 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 PGE2正向调控YAP信号通路 采用免疫印迹和免疫荧光法检测人结肠癌细胞系DLD- 1中PGE2对YAP信号通路的调控，发现饥饿处理的细胞经过PGE2处理后，YAP的表达水平显著增加(图1A，1B)。通过对YAP mRNA和YAP下游调控蛋白(CTGF，CYR61和ANKRD1)水平的检测发现，PGE2可显著增强YAP转录水平和下游信号通路(图1C)。

为了检测PGE2是否在体内同样能调节YAP信号通路，检测了吲哚美辛预处理15- PGDH- KO组和WT组鼠PGE2的表达水平。结果显示，15- PGDH- KO组鼠结肠组织中PGE2的表达水平较WT组增长了2.5倍，吲哚美辛处理10 d后，两组鼠结肠组织中PGE2表达水平几乎均无法检测出(图1B，1D)。15- PGDH- KO组鼠YAP的表达水平及下游靶基因水平均较WT鼠显著升高，采用吲哚美辛处理后均显著降低(图1E,1F)，表明PGE2在体内和体外均可以正向调控YAP的表达水平。

2.2 YAP通过上调EP4和 COX- 2形成正向反馈回路 通过检测转染YAP持续激活突变体(5SA)和对照质粒(WT)的结肠癌细胞系DLD- 1，发现了持续性激活YAP可显著增加 COX- 2和EP4的蛋白表达水平和转录水平(图2A，2B)。采用shRNA敲除YAP导致 COX- 2和EP4的蛋白表达水平和转录水平显著下降(图2C)，同时敲除YAP也阻止PGE2处理上调 COX- 2和EP4的表达(图2D)。

图1 PGE2正向调控YAP信号通路

2.3 YAP调控PGE2介导的结肠再生 PGE2是前列腺肿瘤细胞最常见的促细胞分裂素，通过shRNA敲除前列腺癌细胞系DLD- 1的YAP基因(图3A)，检测了PGE2处理前后细胞的增殖情况。结果发现，PGE2处理可促进对照敲除组细胞的增殖，对YAP敲除细胞系则无显著影响(图3B)。通过构建不同15- PGDH和YAP表达水平的小鼠，并采用DSS处理构建结肠炎小鼠模型，发现15- PGDH- KO组鼠的结肠再生较对照组增多，且体重恢复更快、结肠长度和结肠炎组织学得分更高。进一步对15- PGDH- KO组鼠敲除YAP异源基因(YAP- Het)，同样产生了与WT鼠相似的结肠再生情况(图3D，3E，3F)。

2.4 PGE2异常增加促进结肠癌发生 为了验证PGE2异常的回路是否可以导致细胞的异常增殖和肿瘤的发生，构建了15- PGDH- KO鼠、YAP- KO和DKO鼠。经过长达1年的饲养和观察，发现他们均未发生自发肿瘤，而DKO鼠在培养12～16 w时出现了息肉，并在培养6个月后进展成为原位癌(图4A，4B)。同时发现，DKO鼠结肠部位原位癌和较高的PGE2的表达水平可以显著被YAP敲除或注射吲哚美辛干扰并消除(图4C，4D)。进一步对原位癌部位的YAP，COX- 2和EP4进行转录水平检测，发现DKO鼠中上述基因的表达水平显著高于YAP- KO，也显著高于吲哚美辛处理的DKO鼠(图4E)。

1.Con；2.YAP WT；3.YAP 5SA；4.YAP 5SA/S94A；5.shScrb；6.shYAP图2 YAP通过上调EP4和 COX- 2形成正向反馈回路

图3 YAP调控PGE2介导的结肠再生

图4 PGE2异常增加促进结肠癌发生

3 讨 论

PGE2是一种G蛋白耦联受体(GPCR)配体，通过COX- 2的作用从花生四烯酸合成，并且作为关键的炎症细胞因子〔6〕，在结肠再生和肿瘤发生中起重要作用，因此，PGE2是再生医学和癌症预防的重要药物靶标〔7〕。例如，最近，15- PGDH抑制剂(SW033291)显示通过增加PGE 2促进组织再生〔8〕；另一方面，长期使用降低PGE2的COX抑制剂降低PGE2水平，抑制结肠炎后的结肠再生，但可降低结肠直肠癌发展的风险〔9〕。同时有研究发现EP4(PGE2受体拮抗剂)加剧DSS- 诱导的结肠炎，但可预防结肠肿瘤发生〔10〕。然而，PGE2介导的上述生物学功能的下游效应物尚未被清楚了解。

Yes信号通路相关蛋白(YAP，Hippo通路的下游致癌基因)被证明参与组织再生的调节，特别是YAP对于在DSS介导的结肠损伤后的组织再生是必需的，同时高度活化YAP将导致肠癌的发生，与PGE2表型高度类似〔11〕。文献报道YAP信号通路激活可上调PTGS2(PGE2合成关键酶，又称 COX- 2)和PTGER4(编码EP4)表达，因此推测YAP信号通路也可促进促进PGE2信号通路的激活，与本研究的实验结果一致。结直肠癌的形成与PGE2和YAP信号通路高度相关，且PGE2和YAP在肿瘤形成期间常被显著上调〔5〕，

通过一系列的实验，依次推理和证明了PGE2正向调控YAP信号通路，而YAP通过上调EP4和 COX- 2形成正向反馈回路，同时YAP可调控PGE2介导的结肠再生，异常的PGE2信号激活可促进息肉及结肠癌的发生和发展。本研究的结果清楚地显示了PGE2通过激活YAP正反馈回路促进小鼠结肠炎后结肠再生及癌变的分子机制，表明PGE2在结肠炎和肿瘤发生后的再生期间起到关键作用，有助于结肠炎后的组织再生和结肠直肠肿瘤发生过程的预防和临床治疗。

本研究结果突出显示了YAP在结肠再生过程中的重要调节转录功能，证明YAP的过度表达实际上是肿瘤发生的一个非常重要的风险因素，与文献报道的YAP mRNA在人类结肠癌中增加相吻合〔12〕。以前的研究已经证明长期使用COX抑制剂可通过下调PGE2预防结肠直肠癌的发生和抑制结肠再生的风险〔13〕。本研究也发现，PGE2和YAP之间的正反馈回路是通过COX- 2作为桥接完成的，采用EP4受体拮抗剂可降低DSS介导的结肠炎后结肠再生，但可防止结肠肿瘤的发生，因此PGE2和YAP之间的正反馈回路在结肠再生和结肠直肠肿瘤发生中起着中心作用。

1 Wang D,Dubois RN.Eicosanoids and cancer〔J〕.Nat Rev Cancer,2010;10(1):181- 93.

2 Brown JR,DuBois RN.COX- 2:a molecular target for colorectal cancer prevention〔J〕.J Clin Oncol,2005;23(12):2840- 55.

3 Zhang Y,Desai A,Yang SY,etal.Tissue regeneration.Inhibition of the prostaglandin- degrading enzyme 15- PGDH potentiates tissue regeneration〔J〕.Science,2015;348(6240):aaa2340.

4 Kabashima K,Saji T,Murata T,etal.The prostaglandin receptor EP4 suppresses colitis,mucosal damage and CD4 cell activation in the gut〔J〕.J Clin Invest,2002;109(7):883- 93.

5 Johnson R,Halder G.The two faces of Hippo:targeting the Hippo pathway for regenerative medicine and cancer treatment〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2014;13(1):63- 79.

6 Yu FX,Zhao B,Panupinthu N,etal.Regulation of the Hippo- YAP pathway by G- protein- coupled receptor signaling〔J〕.Cell,2012;150(4):780- 91.

7 Myung SJ,Rerko RM,Yan M,etal.15- Hydroxyprostaglandin dehydrogenase is an in vivo suppressor of colon tumorigenesis〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2006;103(32):12098- 102.

8 Coggins KG,Latour A,Nguyen MS,etal.Metabolism of PGE2 by prostaglandin dehydrogenase is essential for remodeling the ductus arteriosus〔J〕.Nat Med,2002;8(1):91- 2.

9 Castellone MD,Teramoto H,Williams BO,etal.Prostaglandin E2 promotes colon cancer cell growth through a Gs- axin- beta- catenin signaling axis〔J〕.Science,2005;310(5753):1504- 10.

10 Pugh S,Thomas GA.Patients with adenomatous polyps and carcinomas have increased colonic mucosal prostaglandin E2〔J〕.Gut,1994;35(5):675- 8.

11 Yang VW,Shields JM,Hamilton SR,etal.Size- dependent increase in prostanoid levels in adenomas of patients with familial adenomatous polyposis〔J〕.Cancer Res,1998;58(8):1750- 3.

12 Zeng Q,Hong W.The emerging role of the hippo pathway in cell contact inhibition,organ size control,and cancer development in mammals〔J〕.Cancer Cell,2008;13(3):188- 92.

13 Iglesias- Bartolome R,Torres D,Marone R,etal.Inactivation of a Gα(s)- PKA tumour suppressor pathway in skin stem cells initiates basal- cell carcinogenesis〔J〕.Nat Cell Biol,2015;17(6):793- 803.

〔2017- 01- 22修回〕

(编辑 李相军)

付高洁(1983- )，女，主管护师，主要从事消化内科疾病研究。

陶英歌(1979- )，女，主管护师，主要从事消化内科疾病研究。

R57

A

1005- 9202(2017)15- 3681- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.017