吴良邦 吴水培 顾增辉

(杭州市解放军117医院骨科，浙江 杭州 310000)

BMP- 2和IGF- 1基因治疗糖尿病骨折延迟愈合的作用和机制

吴良邦 吴水培1顾增辉

(杭州市解放军117医院骨科，浙江 杭州 310000)

目的 探讨骨形态发生蛋白(BMP)- 2、胰岛素生长因子(IGF)- 1基因治疗糖尿病(DM)骨折延迟愈合的作用和机制。方法 选取6～7周龄雄性Wistar大鼠150只，分为骨折对照组、DM骨折组和治疗组。利用酶联免疫试剂盒检测各组大鼠血清中BMP- 2、IGF- 1的表达；测定各组大鼠血清中碱性磷酸酶(ALP)的含量，以判断对成骨细胞生长的影响；利用放射免疫竞争法检测血清中骨钙素的含量变化；利用局部骨密度仪检测骨折区域局部骨密度的变化情况。结果 术后前3 w，DM骨折组与骨折对照组BMP- 2、IGF- 1的浓度均呈上升趋势，第3周达到最大值，治疗组BMP- 2含量在第2周达到最大值，IGF- 1的浓度在第3周达到最大，随后开始下降、实验中，治疗组BMP- 2、IGF- 1的表达量最高，DM骨折组表达量始终最低。DM骨折组ALP与骨钙素的含量始终显著低于骨折对照组与治疗组，骨折前3 w，治疗组ALP与骨钙素的含量显著低于对照组骨折无显著差异(P>0.05)。骨折区域局部骨密度检测结果显示治疗组骨密度最高，骨折对照组其次，DM骨折组骨密度最低。结论 BMP- 2、IGF- 1基因通过提高DM大鼠骨折愈合过程中与成骨细胞增殖成熟相关的细胞因子的表达，促进骨折愈合过程中骨折区域局部骨密度的增加，从而显著改善DM骨折延迟愈合情况。

糖尿病；骨折延迟愈合；骨形态发生蛋白- 2；胰岛素生长因子- 1

糖尿病(DM)会导致骨质疏松，相较于健康人群而言，DM患者更易发生骨折，而且骨折后愈合延迟，甚至不愈合〔1,2〕。骨形态发生蛋白(BMP)- 2属于转化因子β超家族成员，是一种多功能的分泌性蛋白〔3〕。它能诱导骨髓间充质细胞分化成软骨细胞和成骨细胞，促进新骨形成，同时它还能促进碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素的表达，促进骨基质蛋白表达，使细胞外基质矿化，从而促进骨细胞的成熟〔4,5〕。胰岛素生长因子(IGF)- 1在骨组织的含量丰富，成骨细胞、破骨细胞和某些间质细胞均能合成IGF- 1，IGF- 1通过自分泌和旁分泌的方式调节骨代谢，促进骨髓基质干细胞以及成骨细胞的增殖和分化，它能刺激骨钙素和胶原蛋白的合成，促进形成骨基质，进而促进骨折愈合〔6～8〕。研究发现在骨折区域局部注射BMP- 2等生长因子能明显加快骨折愈合的速度〔9〕，但是外源生长因子提取困难，成本较高，而且临床上应用时可能会出现免疫原性引起的不良反应。本研究旨在探讨BMP- 2、IGF- 1基因对大鼠DM骨折愈合的作用效果。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取6～7周龄雄性Wistar大鼠150只，体重200～220 g。将大鼠放于有恒温控制条件的动物室内进行饲养，光照时间/黑暗时间为12 h/12 h，平均湿度50%，室内平均温度26℃，不限食水。饲养1 w后随机将大鼠分为骨折对照组、骨折组、治疗组，每组50只。

1.2 大鼠DM骨折模型制备 随机选取100只大鼠禁食禁水12 h后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)溶液，48 h后检测大鼠的血糖以及尿糖含量，当血糖含量>16.7 mmol/L，尿糖为以上时对大鼠进行骨折手术处理，无菌条件下对大鼠进行麻醉后，锯断左腿胫骨，并进行缝合固定，术后单笼饲养，每日注射青霉素防止伤口感染，连续注射3 d。剩下的50只大鼠腹腔注射与实验组相同剂量的柠檬酸钠缓冲液，骨折处理同实验组。

1.3 大鼠DM骨折治疗模型制备 从制备好的100只DM骨折模型中随机选取50只大鼠制备DM骨折治疗组模型，胰酶消化事先培养的BMP- 2和IGF- 1共转染的骨髓瘤基质干细胞，洗涤后进行细胞计数，调节细胞浓度为2×106个/ml，以每只大鼠注射0.4 ml细胞液的浓度，将细胞注入骨折局部区域制备治疗模型。

1.4 血液样品采集 造模后各组每周取一次血液样品，连续取6 w，每次各选取6只大鼠取门静脉血5 ml，离心后取血清置于-20℃保存。

1.5 酶联免疫试剂盒检测血清中BMP- 2、IGF- 1的表达 按照说明书稀释标准液，分别设立空白对照孔、标准孔以及待测样品孔，每孔做3个重复。空白孔不加试剂，标准孔加入50 μl稀释好的标准品，待测样品孔加入40 μl样品稀释液以及10 μl待测样品，混匀后置于37℃培养箱培养30 min，去除孔中的液体，并加入稀释过的洗涤液进行洗涤，按照说明书要求加入酶标试剂，混匀后置于37℃避光孵育10 min，加入终止液终止反应。将酶标板置于酶标仪中检测450 nm吸光度值，并进行分析。

1.6 放射免疫竞争法检测血清中骨钙素的含量 利用骨钙素试剂盒检测所取样品血清中骨钙素的含量。将待测样品以及标准液分别与标记抗原加入一起进行竞争性结合反应，置于4℃孵育20 h，待竞争反应达到平衡后，加入分离试剂室温孵育15 min，离心弃上清，放射法测定沉淀物的放射性计数，制作标准曲线进行分析计算样品中骨钙素浓度。

1.7 骨密度检测 术后连续6 w每组分别取6只大鼠进行处死，利用局部骨密度仪检测大鼠以骨折端为中心的2.0 mm×1.5 mm区域内的骨密度，并进行记录。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清中BMP- 2的表达情况 骨折对照组与DM骨折组术后第1～3周，BMP- 2的浓度逐步上升，第3周时达到最大值，随后3 w逐步下降，前3 w两组有显著差异(P<0.05)，后3 w无统计学差异(P>0.05)。治疗组在第2周浓度达到最大，随后开始下降，但治疗组与DM骨折组始终差异显著(P<0.05)，1～4 w治疗组显著高于骨折对照组(P<0.05)，随后2 w与对照组相比无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠血清中IGF- 1的表达情况 3组术后前3 w，血清中IGF- 1含量均逐步上升，第3周时达到最大值。DM骨折组和骨折对照组相比有显著差异(P<0.05)，随后3 w两组逐步下降且无统计学差异(P>0.05)。治疗组术后第4周浓度有所下降，但与DM骨折组相比差异显著(P<0.05)，与骨折对照组在第6周比较有显著差异(P<0.05)。见表2。

2.3 各组大鼠血清中ALP含量比较 3组ALP的含量均随着时间的推移逐渐降低，ALP骨折组ALP下降最快，与骨折对照组相比差异显著(P<0.05)，治疗组显著高于DM骨折组(P<0.05)，治疗后前3 w显著低于骨折对照组(P<0.05)，从第4周开始，治疗组接近于骨折对照组，但两组差异不明显(P>0.05)。见表3。

2.4 各组大鼠血清骨钙素浓度比较 前3 w 3组血清中骨钙素的含量均随着时间的推移均逐渐升高，在第3周达到最高值，之后开始下降。1～6 w DM骨折组与骨折对照组相比差异显著(P<0.05)，治疗组均显著高于DM骨折组(P<0.05)，治疗后前3 w显著低于对照组(P<0.05)，但从第4周开始，治疗组与对照组差异不明显(P>0.05)。见表4。

表1 各组大鼠血清BMP- 2表达情况

与骨折对照组比较：1)P<0.05；与DM骨折组比较：2)P<0.05，下表同

表2 各组大鼠血清IGF- 1表达情况

表3 各组大鼠血清碱性磷酸酶变化情况

表4 各组大鼠血清骨钙素变化情况

2.5 各组大鼠骨折处骨密度比较 术后大鼠的骨痂骨密度随着时间的变化逐渐增大。在术后第1周，各组均没有明显差异，从术后第2周开始，DM骨折组显著小于骨折对照组(P<0.05)，治疗组显著高于DM骨折组(P<0.05)，第2～3周治疗组与骨折对照组相比无显著差异(P<0.05)，从第4周开始，治疗组显著高于对照组(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠骨折区域骨密度测定

3 讨 论

DM属于内分泌性疾病，其发生涉及血液循环系统、神经运动系统等多个系统。DM患者本身骨矿物质较健康人含量少，而高血糖或胰岛素的缺乏也容易引起骨质疏松。

骨折愈合是一个复杂的生理过程，骨再生需要多种细胞因子参与，例如骨形态发生蛋白、成纤维细胞因子、转化生长因子、核结合因子等都对成骨细胞的增殖分化以及对骨生成的调控具有重要作用，其中BMP- 2、IGF- 1对骨折愈合作用最显著。BMP- 2诱导骨髓间基质干细胞分化成软骨细胞和成骨细胞，IGF- 1能促进成骨细胞和成骨前体细胞形成骨基质，二者在促进新骨的形成具有重要作用〔10～12〕。本研究结果说明DM患者骨折愈合早期BMP- 2、IGF- 1表达量下降，引起骨折愈合延迟，基因治疗能促进BMP- 2、IGF- 1的表达，消除DM对骨折愈合的不利影响。血清中ALP的水平是骨细胞早期分化的标志，能反映骨形成的能力，骨钙素的表达水平反映了机体摄取钙的能力，标志着骨细胞的成熟，二者的表达程度间接反映了骨的形成进程〔13，14〕。实验数据表明DM骨折愈合过程中骨的改建过程因受DM的影响而有所滞后，基因治疗能恢复DM小鼠骨折愈合过程的骨改建过程。骨密度直接反映了骨质量情况，是骨折危险性的一个重要依据〔15,16〕，骨密度越高，骨质量越好，说明基因治疗能坚强骨骼，显著改善DM引起的骨质疏松的问题，从而加快骨折愈合。本研究显示DM导致的BMP- 2、IGF- 1生物活性因子含量的降低是延迟骨折愈合的重要因素，BMP- 2、IGF- 1基因治疗通过提高BMP- 2、IGF- 1的含量，并改善与骨形成进程中相关的ALP和骨钙素的含量，提高骨密度从而加快DM大鼠骨折愈合速度，为临床治疗DM骨折延迟愈合提供理论依据。

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〔2017- 05- 11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

浙江省自然科学基金资助项目(No.Y2080991)

吴水培(1951- )，男，主任医师，主要从事创伤修复研究。

吴良邦(1986- )，男，硕士，住院医师，主要从事创伤修复研究。

R683

A

1005- 9202(2017)15- 3678- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.016

1 安徽医科大学解放军九八临床学院