王咏梅 贾新转

(河北医科大学第四医院妇产科，河北 石家庄 050011)

巨噬细胞表达分泌的抗菌肽在卵巢癌发展中的作用及调控机制

王咏梅 贾新转1

(河北医科大学第四医院妇产科，河北 石家庄 050011)

目的 探讨巨噬细胞表达分泌的抗菌肽Hcap18/LL37在卵巢癌发展中的作用及调控机制。方法 构建卵巢癌细胞株OVCAR- 3与巨噬细胞共培养模型，采用Matrigel小室检测巨噬细胞对OVCAR- 3侵袭力的影响；Western印迹法和qRT- PCR检测Hcap18/LL37和VersicanV1蛋白和mRNA的表达水平。使用干扰质粒抑制OVCAR- 3细胞中VersicanV1的表达，分析巨噬细胞中Hcap18/LL37表达和OVCAR- 3细胞的侵袭力。结果 共培养组侵袭穿膜细胞数明显多于OVCAR- 3单独培养组(P<0.05)；Hcap18/LL37抗体共培养组侵袭穿膜细胞数明显少于对照IgG共培养组(P<0.05)。共培养后巨噬细胞中Hcap18/LL37 蛋白和mRNA相对表达量高于单独培养(P<0.01)；OVCAR- 3细胞中Hcap18/LL37蛋白和mRNA相对表达量与单独培养之间差异无统计学意义(P>0.05)。VersicanV1转染卵巢OVCAR- 3细胞与巨噬细胞共培养24 h后，VersicanV1蛋白相对表达量高于OVCAR- 3细胞单独培养时(P<0.01)。巨噬细胞与VersicanV1沉默OVCAR- 3细胞共培养组侵袭穿膜细胞数低于VersicanV1高表达OVCAR- 3细胞共培养组(P<0.01)。结论 卵巢癌内环境中巨噬细胞分泌的抗菌肽Hcap18/LL37促进癌细胞侵袭，其表达受肿瘤细胞分泌的VersicanV1蛋白调控。

巨噬细胞；抗菌肽；卵巢癌；Versican V1

抗菌肽Hcap18/LL37最初被认为是一种先天性免疫细胞分泌的宿主防御肽，可清除微生物。相关研究显示，Hcap18/LL37还具有抗细胞凋亡、促进细胞增殖和血管生成等多样的生物学功能〔1〕。最新研究发现，Hcap18/LL37也可促进肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种癌细胞增殖〔2〕。但其在肿瘤微环境中对癌细胞组间作用和表达调控机制仍未明确。本研究通过构建卵巢癌细胞株OVCAR- 3与巨噬细胞共培养模型，模拟体内卵巢癌内环境，探讨Hcap18/LL37在卵巢癌细胞发展中的作用及表达调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌细胞株OVCAR- 3购于上海邦景实业有限公司；DMEM培养液、胎牛血清购于北京方程生物科技有限公司；巨噬细胞集落刺激因子购于上海贝基生物科技有限公司；兔抗人Hcap18/LL37抗体、兔抗人VersicanV1抗体、鼠抗人β- actin抗体购于上海研生生化试剂有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠抗体购于上海研盟生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 ①人卵巢癌细胞株OVCAR- 3培养：将细胞株接种到含10%胎牛血清的DMEM培养液中，放入CO2孵箱中常规培养。②外周血单个核细胞(PBMC)衍生的巨噬细胞培养：使用单个核细胞分离液，密度梯度离心法分离PBMC，经磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤后，加入含50 ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子的DMEM培养液孵育7 d，诱导分化成巨噬细胞。③人卵巢癌细胞与巨噬细胞共培养：人卵巢癌细胞与巨噬细胞等比例分别培养在6孔板和Transwell培养皿，之后将Transwell插入式细胞培养皿放入6孔细胞培养板中，共培养到说明书指定时间后检测Hcap18/LL37表达情况。

1.2.2 细胞侵袭能力检测 使用Matrigel小室进行检测，人卵巢癌细胞以1×104/孔的密度接种到上室，巨噬细胞以1×104/孔的密度接种到下室。培养3 d后将进入小室滤膜下表面的细胞取出后离心，重悬于100 μl的PBS，甩片。细胞涂片干燥后染色，荧光显微镜下观察并计数侵袭细胞数量。实验组加入3 μg/ml的Hcap18/LL37抗体，对照组加入等浓度的免疫球蛋白(Ig)G。

1.2.3 Western印迹检测 离心收集细胞，抽提总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量，取40 μg总蛋白行10%十二烷基聚丙烯酰胺凝胶(SDS- PAGE)电泳。细胞单独或共培养36 h，将上清液浓缩至原体积的10%，行Nu- PAGE梯度电泳，转膜。室温环境下孵育60 min，洗膜后ECL显影。一抗为兔抗人Hcap18/LL37(1∶1 000)、VersicanV1(1∶500)和鼠抗人β- actin(1∶5 000)；二抗为HRP标记的兔抗鼠抗体(1∶5 000)。

1.2.4 细胞转染 取对数期OVCAR- 3细胞，以1×108/孔的密度接种至2 ml电转缓冲液中，与10 μg VersicanV1感染质粒或对照质粒混合，电转仪进行转染。再将细胞转移到DMEM培养液中，CO2孵箱中培养48 h，更换含10 μg/mL的嘌呤霉素新鲜培养液，每5 d换液1次。培养28 d后Western印迹法鉴定细胞中VersicanV1表达情况，有限稀释法筛选单克隆细胞。

1.2.5 qRT- PCR检测 收集细胞，提取总RNA，逆转录得到cDNA，进行qRT- PCR检测，反应体系20 μl(cDNA 1 μl、Taq酶0.5 μl、dNTP 2 μl、上游和下游引物各1 μl、缓冲液5 μl、双蒸水10.5 μl)；反应条件：94℃ 5 min、94℃ 30 s、60℃ 45 s、70℃ 60 s，共30个循环，β- actin为内参。

1.3 统计学方法 应用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 Hcap18/LL37对人卵巢癌细胞株OVCAR- 3侵袭能力的影响 OVCAR- 3单独培养组、共培养组(OVCAR- 3与巨噬细胞)、Hcap18/LL37抗体共培养组(Hcap18/LL37抗体、OVCAR- 3、巨噬细胞)、对照IgG共培养组(IgG、OVCAR- 3、巨噬细胞)、OVCAR- 3对照IgG培养组(OVCAR- 3单独培养、IgG)的侵袭穿膜细胞分别为(7.85±2.10)个、(108.59±25.82)个、(23.35±6.82)个、(99.60±19.53)个、(7.59±2.37)个。共培养组侵袭穿膜细胞数明显多于OVCAR- 3单独培养组(P<0.05)；Hcap18/LL37抗体共培养组侵袭穿膜细胞数明显少于对照IgG共培养组(P<0.05)。见图1。

图1 巨噬细胞及Hcap18/LL37抗体对OVCAR- 3细胞侵袭力影响(×200)

2.2 OVCAR- 3诱导巨噬细胞表达Hcap18/LL37情况 OVCAR- 3与巨噬细胞共培养后，巨噬细胞中Hcap18/LL37蛋白表达量随培养时间延长而增加；OVCAR- 3细胞中Hcap18/LL37蛋白表达量共培养后无明显变化。共培养后巨噬细胞中Hcap18/LL37 mRNA相对表达量(14.65±2.38)明显高于单独培养时(1.39±0.41)(P<0.01)；OVCAR- 3细胞中Hcap18/LL37 mRNA相对表达量(2.51±0.82)与单独培养时(2.43±0.60)差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 共培养不同时间巨噬细胞和OVCAR- 3细胞中Hcap18/LL37蛋白表达情况

2.3 VersicanV1蛋白在OVCAR- 3细胞中的表达 VersicanV1转染卵巢OVCAR- 3细胞后，Western印迹检测VersicanV1蛋白相对表达量为(5.93±1.28)；与巨噬细胞共培养24 h后表达量为(18.92±3.05)，明显高于OVCAR- 3细胞单独培养时(P<0.01)。

2.4 干扰OVCAR- 3细胞VersicanV1表达对巨噬细胞Hcap18/LL37表达和侵袭力的影响 巨噬细胞单独培养、VersicanV1沉默的OVCAR- 3细胞与巨噬细胞共培养、VersicanV1高表达的OVCAR- 3细胞与巨噬细胞共培养后，巨噬细胞中Hcap18/LL37 蛋白表达水平分别为(3.05±0.42)、(3.89±0.76)、(17.92±4.50)；mRNA相对表达量分别为(0.87±0.06)、(1.10±0.14)、(10.38±3.38)，差异均有统计学意义(P<0.05)。巨噬细胞与VersicanV1沉默OVCAR- 3细胞共培养组侵袭穿膜细胞数分别为(10.30±3.51)个，明显低于与Versican V1高表达OVCAR- 3细胞共培养组〔(115.60±24.95)个，P<0.01〕。

3 讨 论

近年来研究发现，肿瘤微环境中炎性因子水平与肿瘤发生、发展有明显关系〔3〕。本研究结果显示，巨噬细胞可有效提升OVCAR- 3细胞的侵袭力，加入Hcap18/LL37抗体共培养时明显减弱了OVCAR- 3细胞的侵袭力，提示Hcap18/LL37是提升卵巢癌细胞侵袭力的主要因子之一。

相关研究显示，感染和炎症反应可诱导Hcap18/LL37的表达与分泌，但在肿瘤微环境中其调控机制仍未明确〔4〕。本研究说明巨噬细胞是卵巢癌微环境中Hcap18/LL37表达与分泌的主要来源，而非肿瘤细胞本身。

本研究中卵巢癌细胞存在提升了巨噬细胞Hcap18/LL37的表达水平，可能与癌细胞分泌的某种因子介导有关。Versican V1属于Lectiacn家族，表达于肿瘤细胞中，其可降低肿瘤细胞之间及与基质之间的黏附力，提升肿瘤转移和侵袭能力〔5〕。本研究结果提示在卵巢癌微环境中巨噬细胞Hcap18/LL37表达受肿瘤细胞分泌的VersicanV1调控，巨噬细胞可明显提升卵巢癌细胞VersicanV1表达水平，促进肿瘤进展。卵巢癌微环境中，巨噬细胞分泌的抗菌肽Hcap18/LL37可提升癌细胞侵袭力，肿瘤细胞分泌的Versican V1可调控巨噬细胞Hcap18/LL37的表达与分泌，二者形成一个正反馈环。通过抑制巨噬细胞Hcap18/LL37的表达或下调肿瘤细胞Versican V1的表达来抑制卵巢癌的发展有望成为一个新方法。

1 王素琴,安红军,徐胜东,等.P38MAPK通路在老年卵巢癌化疗药物耐药性产生中的作用〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(11):2601- 2.

2 张 彦,满霞霞,刘晓燕,等.上皮性卵巢癌患者特征分析〔J〕.中国卫生工程学,2016;15(1):79- 80,83.

3 唐锐先,张 颖,张 巍,等.白藜芦醇对卵巢癌细胞株SKOV- 3细胞周期的影响及诱导其凋亡的机制研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2016;17(5):611- 5.

4 卢建军,宋建东,张林燕,等.PIK3 CA、TIEG1在老年卵巢癌组织中的表达及意义〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(10):2719- 21.

5 李丹丹,朴金霞,王婷婷,等.临床完全缓解卵巢上皮性癌CA125界值与预后相关性研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2015;16(4):468- 70.

〔2017- 03- 25修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

河北省卫生和计划生育委员会科研基金项目(No.zl20140305)

王咏梅(1970- )，女，硕士，主治医师，主要从事妇产科研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3670- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.012

1 河北医科大学第四医院生殖医学科