刘楠楠 王立英 姜 晶 董志恒 李 才

(北华大学基础医学院病理教研室,吉林 吉林 132013)

苯那普利对糖尿病肾病大鼠肾脏结缔组织生长因子表达的调节作用

刘楠楠 王立英1姜 晶2董志恒 李 才3

(北华大学基础医学院病理教研室,吉林 吉林 132013)

目的 研究苯那普利对糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏结缔组织生长因子(CTGF)表达的调节。方法 Wistar大鼠34只，随机分为：对照组、DN、苯那普利组。DN组及苯那普利组大鼠经腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立DN模型。于实验第12周末处死大鼠测量大鼠体质量、空腹血糖、肾功能、尿白蛋白排泄率(UAER)及24 h尿总蛋白。应用免疫组化方法检测肾脏CTGF蛋白表达，并进行半定量分析。结果 与对照组相比，DN组大鼠空腹血糖、血尿素氮、血清肌酐、UAER 及24h尿总蛋白显著升高(P<0.05或P<0.01)；肾脏CTGF表达增加(P<0.05)。DN大鼠苯那普利组各项检测指标均较模型组显著改善(P<0.05或P<0.01)。结论 苯那普利可下调DN苯那普利肾组织CTGF的表达，降低蛋白尿，保护肾功能。

肾组织;苯那普利;结缔组织生长因子;糖尿病肾病

糖尿病肾病(DN)是最常见的糖尿病微血管并发症，其主要病理特征为肾小球系膜基质积聚、肾小球和肾小管基底膜增厚及肾间质纤维化，已成为终末期肾衰竭和糖尿病患者死亡的主要病因〔1〕。在DN导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化的过程中，结缔组织生长因子(CTGF)是关键性细胞因子之一，参与纤维化过程〔2〕。本研究建立链脲佐菌素(STZ)诱导的DN大鼠模型，观察苯那普利对DN大鼠肾组织CTGF表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 Wistar大鼠34只，体重197～255 g，雌雄各半，健康状态良好，血糖正常，购自吉林省药品检验实验动物科。实验期间所有动物自由饮水进食，保持室内通风、垫料干燥。

1.2 仪器、试剂及药品 LD5- 2A医用离心机，北京医用离心机厂制造；日立7150型自动生化分析仪，日本生产；T1000电子天平，常熟双杰测试仪器厂；血糖测定仪，三诺公司；Olympus 显微镜，日本。STZ购自美国Sigma公司；苯那普利，购自北京诺华公司；兔抗人CTGF多克隆抗体，购自上海颖心实验设备有限公司；尿白蛋白酶免疫法试剂盒，购自上海德波生物技术公司；血糖高灵敏度试剂盒，购自汇力生物工程技术有限公司；尿葡萄糖检测试纸片，购自桂林中辉生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与DN模型制备 Wistar大鼠34只，随机分为对照组(n=10)、DN模型组(n=12)、苯那普利组(n=12)。给DN组及苯那普利组大鼠腹腔一次性注射STZ 60 mg/kg。给对照组腹腔注射不含STZ的同等体积的缓冲液。72 h后由尾尖静脉采血测量空腹血糖，当空腹血糖≥16.7 mmol/L，3 w后检测24 h尿蛋白定量，当其>30 mg时，为DN模型建立成功。随后将造模成功的大鼠分为DN组及苯那普利组。稳定1 w后，给DN组大鼠每日灌服苯那普利10 mg·kg-1·d-1。对照组及DN组给予等量生理盐水灌服，连续灌服12 w。实验期间所有大鼠未给胰岛素及其他降糖药物。给实验大鼠腹腔注射STZ后，其多饮、多食及多尿表现显明。但DN组有4只死亡，而苯那普利组有3只死亡。

1.3.2 标本留取 实验第12周时，给各组大鼠称重，并经尾静脉采血测量空腹血糖，并用代谢笼收集大鼠24 h尿样，记录尿量，离心除掉沉渣，-20℃保存待测尿白蛋白。给所有动物乙醚麻醉，处死动物，眶后静脉采血，肝素抗凝，分离血清(2 000 r/min,10 min)，保存于-74℃冰箱。剖开腹腔，取出肾脏，用生理盐水清洗，去掉包膜，使用精密天平称重，经肾门冠状面取肾组织，置入10%中性福尔马林液固定待作免疫组化检查。

1.3.3 生化指标测定 尿白蛋白排泄率(UAER)、尿素氮、空腹血糖、血肌酐采用全自动生化分析仪测定。尿总白蛋白采用双缩脲法测定。

1.3.4 免疫组化测定 将已用10%福尔马林液固定的肾组织，石蜡包埋，制片4 μm厚，二甲苯脱蜡，酒精脱水，滴加3%甲醛H2O2封闭内源性过氧化物酶，滴加兔抗人CTGF多克隆抗体(1∶100)工作液，室温孵育60 min，此后加入生物素标记山羊抗兔IgG，室温孵育20 min，再加入链霉素生物素辣根过氧化物酶工作液，室温孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，常规脱水，透明，树胶封片，磷酸盐缓冲液(PBS)替代Ⅰ抗作阴性对照。对图像进行分析应用Image- pro plus图像分析系统，随机选取8个不重叠视野(×400)，测定阳性染色部位的积分光密度值为半定量分析值。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 体质量、肾质量及肾质量/体质量状况 实验前各组大鼠体质量均无明显不同。成模后在实验第12周时，DN组及苯那普利组大鼠体质量减轻，与对照组比较有统计学差异(P<0.01或P<0.05)。苯那普利组成模后至12 w末时体质量较DN组明显增加(P<0.05)。但苯那普利组肾质量/体质量与DN组比较显著降低(P<0.01)，见表1。

2.2 生化指标 实验前各组大鼠血糖比较均无明显差异。12 w末时，苯那普利组与DN组空腹血糖较对照组显著增高(P<0.01)，苯那普利组与DN组显著降低(P<0.01)。肾功能指标，DN组大鼠UAER、尿总蛋白、尿素氮、血肌酐较对照组显著升高(P<0.01)，与DN组比较，苯那普利组UAER、尿总蛋白、血肌酐及尿素氮均明显下降(P<0.01)，见表2。

2.3 肾组织CTGF的表达 免疫组化结果显示，CTGF在肾小球系膜细胞、上皮细胞及系膜区的阳性表达呈棕黄色颗粒。CTGF在对照组大鼠肾小球内表达微弱(呈轻微着色，仅见少量浅淡黄色颗粒)；DN组大鼠CTGF表达明显增强(着色加深，呈棕黄色)；苯那普利组大鼠CTGF表达较DN组减轻(着色变浅，呈浅黄色)。见图1。半定量结果表明，DN组(0.50±0.09)较对照组(0.31±0.05，P<0.05)显著增强；苯那普利组(0.38±0.07)较DN组显著降低(P<0.05)。

表1 各组大鼠体质量、肾质量、肾质量/体质量比较

与对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.05；与DN组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

表2 各组相关指标比较

与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01

图1 肾组织CTGF免疫组化染色结果(DAB，×400)

3 讨 论

DN的明确发病机制并不十分清楚，目前认为多种因素可能与DN的发生有关。但在DN机制中CTGF的作用越来越受到广泛关注。CTGF属于即刻早期基因CCN家族成员之一。近年研究发现，CTGF与包括血管、心脏、肾脏、胰腺、肺及肝脏等在内的许多组织器官纤维化发生发展密切相关〔3～5〕。正常情况下，体内的CTGF表达很低或无表达，但在肾等器官病理状态下，便会出现CTGF过度表达〔6〕。初步研究表明，在肾脏疾病时，CTGF主要表达于肾脏中起源于中胚层的固有细胞，如脏层上皮细胞、壁层上皮细胞、系膜细胞〔7〕。Ren等〔8〕在研究中发现，在糖尿病状态下，肾脏分泌或产生更多的转化生长因子β(TGF- β)，进而促进CTGF等细胞因子的作用。但从DN早期开始系膜细胞与肾小球足细胞的CTGF表达呈显著升高〔9〕。

正常状态下，CTGF的含量很低，高血糖、晚期糖基化终末产物(AGEs)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及机械应力等作用可以使CTGF过度表达，结果引起细胞外基质(ECM)成分，如纤维连接蛋白(FN)，胶原等的增多，并参与DN发生〔10〕。研究提示，CTGF可能是TGF- β1促纤维化活性的下游信号介质，在刺激细胞增殖及ECM的形成、促进组织器官纤维化方面起重要作用〔11〕。AGEs是高血糖环境中糖与蛋白质上的游离氨基酸、脂肪及核酸之间反应形成，当AGEs同特异受体结合影响生长因子及细胞因子如CTGF与TGF- β的表达，导致ECM的合成和降解失衡，引发肾纤维〔12〕。高血糖状态下，肾组织CTGF产生增多，可能是由于糖尿病糖代谢紊乱所致。因此控制高血糖，减少AGEs的形成，也是防止糖尿病发展为DN的重要措施。

本研究结果提示，应用苯那普利对DN大鼠进行干预，可明显减轻其肾脏的病理性损伤，其作用机制很可能与苯那普利下调DN大鼠肾组织中CTGF的表达有关。已有研究证实，在DN早期即有血、尿及肾组织中CTGF水平增高〔13〕。尿中CTGF浓度与DN的严重程度，即UAER和肾小球滤过率呈正相关〔10〕。尿蛋白增多不仅是DN损害的表现，而且也是肾病和心血管病进展的重要因素〔14〕，说明肾组织中CTGF表达水平的变化通常与DN的严重程度密切相关。本实验结果提示，苯那普利通过抑制DN大鼠肾组织中CTGF的表达，而发挥其保护肾功能的作用机制。

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〔2016- 01- 28修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

刘楠楠 (1976- )，女，医学博士，副教授， 主要从事糖尿病肾病及肿瘤分子病理研究。

R587.2

A

1005- 9202(2017)15- 3659- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.008

1 北华大学基础医学院生理教研室 2 北华大学附属医院病理科 3 吉林大学再生医学科学研究所