杨化冰 张茂林 张 翀 付玉山

(湖北中医药大学基础医学院，湖北 武汉 430065)

补脏通络方对糖尿病大鼠肾组织Ⅳ型胶原、转化生长因子- β表达及基质金属蛋白酶- 9/金属蛋白酶抑制剂- 1平衡的影响

杨化冰 张茂林 张 翀 付玉山1

(湖北中医药大学基础医学院，湖北 武汉 430065)

目的 观察补脏通络方对糖尿病(DM)大鼠肾组织Ⅳ型胶原(Ⅳ- C)、转化生长因子(TGF)- β表达及基质金属蛋白酶(MMP)- 9/金属蛋白酶抑制剂(TIMP)- 1平衡的影响。方法 大鼠以脂肪乳灌胃21 d后一次性尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg造模，后予补脏通络方治疗。于第8周末取左肾，测算肾重指数；SABC- FITC免疫组织化学荧光法检测肾组织Ⅳ- C、TGF- β表达；免疫印迹法分析肾组织MMP- 9、TIMP- 1蛋白含量。结果 病理组较正常组肾重指数增加(P<0.01)，各治疗组较病理组肾重指数降低(P<0.01)。病理组肾小球体积增大，系膜区扩大病变经治疗后均有不同程度改善。病理组较正常组，肾组织Ⅳ- C、TGF- β、TIMP- 1表达增高(P<0.01)，MMP- 9表达和MMP- 9/TIMP- 1比值下降(P<0.01)；各治疗组较病理组，肾组织Ⅳ- C、TGF- β、TIMP- 1表达下降(P<0.01)，MMP- 9表达和MMP- 9/TIMP- 1比值上升(P<0.01)；中、高剂量组降低TIMP- 1表达，升高MMP- 9/TIMP- 1比值的作用优于低剂量组(P<0.01)。结论 下调肾组织TGF- β表达，调节MMP- 9/TIMP- 1平衡，促进胶原降解，可能是补脏通络方保护DM肾脏作用的机制之一。

2型糖尿病；基质金属蛋白酶(MMP)- 9；金属蛋白酶抑制剂(TIMP)- 1；补脏通络方；Ⅳ型胶原(Ⅳ- C)；转化生长因子(TGF)- β

补脏通络方以生黄芪与玄参为君；生晒参、麦冬、水蛭、川贝为臣；淮山药、丹参为佐使，共奏益气养阴补脏、祛瘀化痰通络之功。前期研究显示补脏通络方能明显延缓糖尿病(DM)大鼠肾组织毛细血管基底膜增厚改变，保护其肾组织〔1～3〕，然而其具体机制尚有待阐明。研究表明糖尿病肾病(DN)早期病理改变主要为肾脏肥大、肾基底膜增厚及系膜区为主的细胞外基质(ECM)积聚，Ⅳ型胶原(Ⅳ- C)是肾小球ECM的重要成分之一，Ⅳ- C的降解与基质金属蛋白酶(MMP)- 9/金属蛋白酶抑制剂(TIMP)- 1的参与密切相关，而TGF- β被认为是DN中导致ECM积聚的重要因子，并证明是MMPs/TIMPs平衡最重要的调控因子〔4～7〕。本文观察补脏通络方对DM大鼠肾组织Ⅳ- C、TGF- β表达及MMP- 9/TIMP- 1平衡的影响。

1 材料和方法

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠60只，8周龄，体重(200±20)g，由武汉大学医学院实验动物中心提供。

1.2 药物 补脏通络方由生黄芪、淮山药、丹参、玄参、麦冬、生晒参、川贝、水蛭按4∶4∶3∶3∶3∶2∶2∶1构成，药材购自湖北省中药材有限公司，在湖北省中医附院中药房制成1 g生药/ml、2 g生药/ml及4 g生药/ml水煎液。

1.3 主要试剂与仪器 链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，0.1 mol/L(pH4.4) 的柠檬酸钠- 柠檬酸缓冲液冰浴下配置成 0.5% STZ 溶液，现配现用。兔抗鼠Ⅳ- C多克隆抗体、兔抗鼠TGF- β多克隆抗体、兔抗鼠MMP- 9、TIMP- 1多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，购自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz， CA)；SABC- FITC试剂盒，购自北京中杉金桥生物科技公司；日本Olympus- CH30显微镜；One touch Ultra血糖测定仪，美国Johnson & Johnson公司；变性凝胶电泳和免疫印迹所用试剂及仪器，Palo Alto，CA USA和Bio- Rad (Richmond，CA，USA)。

1.4 模型的建立与分组 随机挑选10 只大鼠作为正常组，给予正常饲料喂养。余下大鼠以脂肪乳灌胃21 d后一次性尾静脉快速注射STZ 30 mg/kg，72 h后测空腹血糖(FPG)≥11.1 mmol/L者为大鼠DM模型〔8〕。成模大鼠随机分为病理组、补脏通络方低剂量组(低剂量组)、补脏通络方中剂量组(中剂量组)、补脏通络方高剂量组(高剂量组)。低、中、高剂量组分别给予补脏通络方1、2、4 g/ml灌胃；正常组、病理组给予生理盐水灌胃。灌胃剂量均为1 ml/100 g，1次/d。治疗期间饮食不变，治疗周期为8 w。

1.5 指标的检测 大鼠于给药第8周末处死，打开腹腔，经腹主动脉插管，以生理盐水灌洗肾脏后统一取左肾，以电子天平称肾脏湿重，测算肾重指数。SABC- FITC免疫组织化学荧光法检测大鼠肾组织Ⅳ- C、TGF- β的表达：取肾组织，以4%多聚甲醛固定，浸蜡及包埋，切片(厚度为5 μm)，3%H2O2室温孵育10 min，正常山羊血清室温封闭20 min，滴加一抗，37℃孵育2 h，滴加二抗，37℃孵育20 min；在荧光显微镜下用紫外光激发，观察标记效果；以Image- pro plus图像处理系统测平均光密度作免疫组化半定量分析。免疫印迹法分析肾组织MMP- 9、TIMP- 1蛋白含量：取肾组织样本匀浆，BCA法进行总蛋白浓度测定，SDS- PAGE电泳，蛋白质以8%～10%凝胶分离后转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1.5 h，滴加一抗4°C孵育过夜，次日滴加二抗室温下孵育2 h，显影、洗片、扫描；利用Photoshop软件分析蛋白印迹条带的灰度值，以β- actin信号值校正，设正常组灰度值为1，其他组与正常组相比取值。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行方差分析及q检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠肾重指数的比较 病理组肾脏指数〔(6.59±0.57)mg/g〕较正常组〔(4.65±0.27)mg/g〕显著增加(P<0.05)，低剂量组〔(5.22±0.23)mg/g〕、中剂量组〔(5.10±0.18)mg/g〕、高剂量组〔(5.13±0.14)mg/g〕肾重指数较病理组显著降低(P<0.01)。

2.2 各组大鼠肾组织Ⅳ- C、TGF- β表达水平的比较 如图1，图2所示，免疫组化染色在光镜下观察结果：病理组与正常组相比，肾小球体积普遍增大，系膜区扩大，与病理组相比，各治疗组上述病变均有不同程度的改善。正常组在肾小管上皮细胞内Ⅳ- C、TGF- β表达弱阳性，着色极浅；病理组在肾小管上皮细胞、系膜细胞、间质细胞内Ⅳ- C、TGF- β表达强阳性，着色深(P<0.01)；各治疗组在上述部位阳性表达(P<0.01)，见表1。

图1 各组大鼠肾组织Ⅳ- C免疫组化染色(DAB，×100)

图2 各组大鼠肾组织TGF- β免疫组化染色(DAB，×100)

2.3 各组大鼠肾组织MMP- 9、TIMP- 1表达及MMP- 9/TIMP- 1比值的比较 病理组较正常组TIMP- 1表达明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)，MMP- 9表达和MMP- 9/TIMP- 1比值明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；各治疗组较病理组TIMP- 1表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，MMP- 9表达和MMP- 9/TIMP- 1比值明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)；中、高剂量组较低剂量组，TIMP- 1表达下降，差异有统计学意义(P<0.01)，MMP- 9/TIMP- 1比值升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠肾组织Ⅳ- C、TGF- β、MMP- 9、TIMP- 1表达及MMP- 9/TIMP- 1比值的比较

与病理组比较:1)P<0.01；与低剂量组比较:2)P<0.01

3 讨 论

“脏虚络痹”是临床辨治慢性病和老年病的病机理论。痰瘀阻络，脏气虚损贯穿糖尿病大血管病变始终。肺脾肾气阴两虚为主的脏虚化生瘀痰继发病邪，瘀痰留滞在脉络中，日久互结并沉积于脉络壁中，络气痹阻，反过来又会加重脏虚，脏虚又进一步化生痰瘀加重络痹，终成脏虚、络痹的恶性循环。瘀痰形成了固定不移的脉络之癓瘕，致使血管壁增厚，从而引发糖尿病大血管病变。补脏通络基本方以生黄芪与玄参为君；生晒参、麦冬、水蛭、川贝为臣；淮山药、丹参为佐使，共奏益气养阴补脏、祛瘀化痰通络之功。

MMPs是一大类能降解ECM的锌依赖性肽链内切酶家族，TIMPs为其特异性抑制剂。MMPs可以降解所有ECM成分，其中MMP- 9为明胶酶，是降解Ⅳ- C的最主要成员，TIMP- 1可特异性抑制MMP- 9的活性〔9，10〕。研究显示TGF- β能抑制MMPs和促进TIMPs的合成，从而减少ECM 的降解，促进DN的发生、发展〔4～6〕。本研究结果表明，补脏通络方能够降低肾重指数，一定程度改善肾小球体积增大及系膜区扩大等病变，对糖尿病肾脏具有保护作用。补脏通络方还能够降低DN大鼠肾组织TGF- β的过度表达，调控MMP- 9/TIMP- 1平衡。通过升高MMP- 9表达，降低TIMP- 1表达，使MMP- 9/TIMP- 1比值上升，从而促进肾组织Ⅳ- C降解，减少ECM 沉积，改善DN早期病变。推测，下调肾组织TGF- β表达，调节MMP- 9/TIMP- 1平衡，促进胶原降解，可能是补脏通络方保护DN肾脏作用的机制之一。

1 杨化冰,吴 勇,徐丹林,等.补脏通络方对2型糖尿病肾组织保护机制的实验研究〔J〕.中医研究,2007；20(8):14- 6.

2 杨化冰,邱幸凡.论“脏虚络痹”是2型糖尿病基本病机〔J〕.中医药学报,2007;35(4):6- 8.

3 杨化冰,徐丹林,马 骏.补脏通络方对糖尿病大血管保护作用机制〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(21):6135- 6.

4 汤 珣.MMPs/TIMPs与肾脏纤维化〔J〕.国外医学泌尿系统分册,2001;21(增刊):149- 51.

5 王秋月.MMPs/TIMPs、TGF- β1、细胞外基质与糖尿病肾病〔J〕.国外医学内分泌学分册,2003;23(3):201- 3.

6 胡 玲.MMPs/TIMPs、TGF- β1及PKC与糖尿病肾病〔J〕.医学综述,2005;11(12):1097- 9.

7 杨敬华.PKC- MMPs/TIMPs信号转导在糖尿病肾病发病机制中的作用〔D〕.长沙：中南大学,2006.

8 庞宗然,李晓军,刘祖涵,等.2型糖尿病合并大血管病变动物模型的建立和评价〔J〕.中国中医基础医学杂志,2009;15(9):656- 8.

9 Oiszynski K,Zimoska M.Structure and function of matrix metalloproteinases〔J〕.Postepy Biochem,2009;55(1):76- 84.

10 陈 东,严 激.动脉粥样硬化中基质金属蛋白酶的研究进展〔J〕.安徽医药，2010;14(8):874.

〔2016- 06- 27修回〕

(编辑 曹梦园)

Effect of BuzangTongluo Decoction on the expression of Ⅳ- collagon,transforming growth factor- β and matrix metalloproteinases- 9/tissue inhibitor of matrix metalloproteinases- 1 ratio in diabetic renal tissues

YANG Hua- Bing,ZHANG Mao- Lin,ZHANG Chong,etal.

Basic Medical Sciences of Hubei University of Chinese Medicine School,Wuhan 430065,Hubei,China

Objective To study effect of BuzangTongluo Decoction on the expression of Ⅳ- collagon (Ⅳ- C),transforming growth factor (TGF)- β and MMP- 9/TIMP- 1 ratio in diabetic renal tissues and discuss the mechanism of BuzangTongluo Decoction intervening diabetic nephropathy.Methods Rats were fed with fat milk and injected with STZ 30 mg/kg to make model and treated with BuZangTongluo Decoction.Left kidney was taken at end of 8 w,then the kidney weight index was calculated and the expression of Ⅳ- C,TGF- β,MMP- 9,TIMP- 1 in renal tissues were observed with SABC- FITC immunohistochemical fluorescence and Western blot.Results After treated with BuzangTongluo Decoction,the pathological changes in glomerular volume and mesangial area were improved to some degrees compared with pathological group.Compared with normal group,the kidney weight index and the expression of Ⅳ- C,TGF- β,TIMP- 1 were increased as well as MMP- 9,MMP- 9/TIMP- 1 ratio decreased in pathological group,the differences were statistically significant (P<0.01).Compared with pathological group,the kidney weight index and the expression of Ⅳ- C,TGF- β,TIMP- 1 were decreased as well as MMP- 9,MMP- 9/TIMP- 1 ratio increased in treatment groups,the differences were statistically significant (P<0.01).Conclusions The mechanism of BuzangTongluo Decoction intervening diabetic nephropathy may be related to its regulation on the expression of TGF- β and MMP- 9/TIMP- 1 ratio to enhance collagen degradation in renal tissues.

Type 2 diabetes; Matrix metalloproteinases (MMP)- 9; Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases(TIMP)- 1; BuzangTongluo Decoction; Ⅳ collagen(Ⅳ- C); Transforming growth factor (TGF)- β

国家自然科学基金(81202733；81673867)；武汉市卫计委临床医学科研项目(WZ14B11)

付玉山(1968- )，男，主任医师，主要从事中西医结合防治糖尿病研究。

杨化冰(1974- )，女，医学博士，教授，主要从事糖尿病中医病机研究。

R587

A

1005- 9202(2017)15- 3653- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.006

1 武汉市蔡甸中医院内科