尚春香 付宏伟 南 征 马吉成 李 叶

(青海省第五人民医院肿瘤科，青海 西宁 810007)

Notch1表达对肾癌细胞生物学行为的影响

尚春香 付宏伟1南 征 马吉成 李 叶

(青海省第五人民医院肿瘤科，青海 西宁 810007)

目的 探讨Notch1表达对肾癌细胞生物学行为的影响。方法 通过Western印迹检测Notch1在人正常肾小管上皮细胞HK- 2，人肾癌细胞786- O，Caki- 1，769- P，GRC- 1及ACHN中的表达；siRNA Notch1及siRNA NC转染肾癌细胞48 h后，Western印迹及RT- PCR检测转染情况，MTT法及Hoechst染色检测细胞活力及凋亡情况，Transwell法检测细胞迁移侵袭能力，Western印迹检测Bax，Bcl- 2，基质金属蛋白酶(MMP)2，MMP9蛋白表达。结果 HK- 2细胞中Notch1蛋白表达量显著低于5株肾癌细胞786- O，769- P，GRC- 1，Caki- 1及ACHN，且在Caki- 1中Notch1表达量最高，因此作为后续实验的细胞株。siRNA Notch1及siRNA NC转染肾癌细胞48 h后，与siRNA NC组比较，siRNA Notch1组Notch1蛋白及mRNA表达量下调，细胞活力降低，细胞凋亡率提高，细胞侵袭数目减少，Bax表达量上调，Bcl- 2、MMP2及MMP9表达量下调(P<0.01)。结论 Notch1低表达能显著抑制肾癌细胞Caki- 1的恶性生物学行为，可能与调控细胞凋亡蛋白及下调MMPs表达有关。

Notch1；肾癌细胞；增殖；凋亡；侵袭

肾癌又称为肾细胞癌，发病隐匿，一旦确诊常处于晚期，且主要治疗方式为手术根治性切除，但预后差〔1〕。Notch信号通路对于细胞的增殖、凋亡、分化、迁移发挥着类似于干细胞自我更新的作用，且研究显示此信号通路是一种独立的小脑视网膜多发毛细血管瘤(VHL)/缺氧诱导因子(HIF)途径，与肾癌的发生发展密切相关〔2〕。Notch有4种常见的受体(Notch1～Notch4)，其中Notch1研究最为广泛。Notch1在包括肾癌在内的多种肿瘤组织高度表达〔3〕。研究还显示小分子RNA干扰Notch1能显著抑制Caki- 1细胞增殖〔4〕；而过度活化的Notch1对于Caki- 1细胞的增殖具有促进作用〔5〕，但具体的作用机制未知。本研究将继续探讨Notch1对肾癌细胞生物学行为的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人正常肾小管上皮细胞HK- 2，人肾癌细胞786- O、Caki- 1、769- P、GRC- 1及ACHN均购于中科院上海细胞库。

1.2 试剂及仪器 四唑盐试剂(MTT)，结晶紫(美国sigma公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒，Hoechst 33258染色试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)；LipofectamineTM2000，Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)；兔抗人Bax，Bcl- 2，基质金属蛋白酶(MMP)2，MMP9，甘油醛- 3- 磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(美国Epitmics公司)；Transwell 小室(美国Corning 公司)；siRNA Notch1，Notch1 NC(广州锐博生物技术有限公司)。DMI4000倒置荧光显微镜(德国莱卡公司)；DYCZ- 25D型双垂直电泳仪，DYCZ- 25D型转印电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；Gel Doc XR凝胶成像系统(美国伯乐公司)。

1.3 细胞转染 当肾癌细胞生长达到50%的时候，利用LipofectamineTM2000脂质体将siRNA Notch1，Notch1 NC转染到肾癌细胞，6 h后换成含10%血清的DMEM培养基，Western印迹及RT- PCR检测细胞中Notch1蛋白及mRNA的表达。

1.4 噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力 将5×103个肾癌细胞接种到96孔板，培养24 h后，按1.3转染48 h后，每孔加入20 μl的MTT(终浓度为5 mg/ml)，继续培养4 h后，弃去上清液，每孔加入150 μl的二甲基亚砜，使沉淀物溶解，10 min后，于酶标仪波长570 nm处测定OD值，OD值即代表细胞活力。每组平行3个实验。

1.5 Hoechst染色检测细胞凋亡 将1×104个肾癌细胞接种到6孔板，培养24 h后，按1.3转染48 h后，收集细胞，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，将Hoechst染色液加入6孔板，在室温条件下避光染色15 min，并在荧光显微镜下观察细胞形态，细胞发白发亮说明细胞呈凋亡状态。每组平行3个实验。

1.6 Transwell法检测细胞侵袭 在实验前Transwell小室微膜上均匀铺上Matigel胶备用。肾癌细胞按1.3转染后，用胰蛋白酶将细胞消化下来，接种到Transwell的上室，而下室不接种细胞，仅加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48 h后，将小室取出来，用多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，结晶紫染色5 min，置于倒置荧光显微镜下观察，并对Transwell的下室中随机5个视野中的细胞数目进行计数，并取平均值，即为细胞的侵袭数目。每组平行3个实验。

1.7 RT- PCR检测Notch1 mRNA在肾癌细胞株中的表达 根据Trizol试剂盒提取细胞总的RNA，并检测总RNA的纯度。接着利用一步法RT- PCR试剂盒将RNA逆转录成cDNA，并用cDNA进行扩增，最后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增的产物。Notch1上游引物：5′- CCTTTGTGCTTCTGTTCTTCG- 3′，下游引物：5′- CCACTCATTCTGGTTGTCGTC- 3′。 GAPDH作为内参，上游引物：5′- AGCCACATCGCTCAGACA- 3′，下游引物5′- TGGACTCCACGACGTACT- 3′。

1.8 Western印迹检测细胞中Bax，Bcl- 2，MMP2，MMP9的表达 将1×104个肾癌细胞接种到6孔板，培养24 h后，按1.3进行转染，在冰浴条件下将转染好的细胞刮下来，离心收集细胞，并用细胞裂解液裂解细胞30 min，4℃离心得到的上清液就是总蛋白。蛋白浓度根据BCA试剂盒来测定，测定后将蛋白煮沸10 min，使蛋白变性，然后上样，上样量大约30 ng左右，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h，接着湿法转膜30～40 min。转膜结束后，将膜置于2%的胎牛血清(BSA)中于室温条件下封闭1 h。接着将膜放入一抗溶液(兔抗人Bax，Bcl- 2，MMP2，MMP9，GAPDH单克隆抗体，稀释度1∶100)中孵育，4℃过夜；第2天将膜取出，放入二抗溶液在室温条件下孵育1～2 h。凝胶成像系统中曝光。用Quantity one软件分析各抗体条带灰度值。

1.9 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 Notch1在人正常肾小管上皮细胞HK- 2及5株肾癌细胞株中的表达情况 Notch1在人正常肾小管上皮细胞HK- 2，人肾癌细胞786- O，769- P，GRC- 1，Caki- 1及ACHN中的表达，结果表明HK- 2细胞(0.18±0.02)中Notch1蛋白表达量显著低于5株肾癌细胞(0.35±0.03，0.48±0.05，1.23±0.12，1.37±0.13，0.38±0.04)，且在Caki- 1中Notch1表达量最高，因此作为后续实验的细胞株。见图1。

2.2 siRNA Notch1在Caki- 1细胞中的表达 siRNA Notch1及Notch1 NC在Caki- 1细胞转染48 h后，二者蛋白及mRNA表达量分别为〔(0.83±0.08 vs 0.16±0.01)及(1.01±0.10 vs 0.19±0.02)，P<0.01〕。见图2。

2.3 siRNA Notch1对Caki- 1细胞活力及凋亡的影响 见图3。

A：HK- 2；B：786- O；C：769- P；D：GRC- 1；E：Caki- 1；F：ACHN图1 Notch1在人正常肾小管上皮细胞HK- 2及5株肾癌细胞株中的表达情况

A：Notch1 NC组；B：siRNA Notch1组图2 siRNA Notch1在Caki- 1细胞中的表达

图3 siRNA Notch1对Caki- 1细胞凋亡的影响

siRNA Notch1组(0.34±0.03)细胞活力显著低于Notch1 NC组(0.76±0.07)(P<0.01)。通过Hoechst染色实验发现，siRNA Notch1组(38.45±3.80)%细胞凋亡率显著高于Notch1 NC组(5.70±0.57)%(P<0.01)。

2.4 siRNA Notch1对Caki- 1细胞侵袭能力的影响 Caki- 1细胞转染48 h后，siRNA Notch1组(43.21±4.30)细胞侵袭数目显著低于Notch1 NC组(145.38±14.98,P<0.01)。见图4。

图4 siRNA Notch1对Caki- 1细胞侵袭能力的影响(×200)

2.5 siRNA Notch1对Caki- 1细胞中Bax及Bcl- 2表达量的影响 Caki- 1细胞转染48 h后，与Notch1 NC组比较，siRNA Notch1组Bax表达上调，Bcl- 2表达下调(P<0.01)。见图5，表1。

2.6 siRNA Notch1对Caki- 1细胞中MMPs表达量的影响 Caki- 1细胞转染48 h后，与Notch1 NC组比较，siRNA Notch1组MMP2及MMP9表达下调(P<0.01)。见图6，表1。

图5 siRNA Notch1对Caki- 1细胞中Bax及Bcl- 2表达量的影响

图6 siRNA Notch1对Caki- 1细胞中MMPs表达量的影响

组别Bcl-2/GADPHBax/GADPHMMP2/GADPHMMP9/GADPHNotch1NC组0.98±0.100.32±0.030.87±0.091.33±0.13siRNANotch1组0.38±0.031)1.12±0.101)0.20±0.021)0.46±0.041)

与Notch1 NC比较：1)P<0.01

3 讨 论

Notch主要信号蛋白上的受体与配体结合，将信号传递给下一个受体并引起一系列分解过程，从而调控细胞的增殖，分化，凋亡等过程〔6〕。因此，Notch信号通路在胚胎发育，神经退行性疾病，免疫功能紊乱及肿瘤的发生过程中发挥着重要作用〔2〕。Notch1于1991年从人类T淋巴细胞白血病中首次被鉴定出来，位于人类染色体9q34.3染色体上，通过调控细胞的增殖、凋亡等生命过程影响着肿瘤的发生发展〔7〕。研究显示Notch1与Notch信号通路的其他蛋白在肾透明细胞癌组织阳性表达率高于正常肾组织，并与肿瘤的病理分级、大小等临床参数密切相关，提示Notch1对于肾癌的诊断及预后具有显著意义〔3〕。另外研究还表明Notch1在肾癌细胞Caki- 1及786- O中的表达量显著高于正常肾小管上皮细胞HK- 2，且干扰Notch1表达能显著降低Caki- 1细胞活力，但具体的作用机制尚未见报道〔4〕。张振等〔4〕研究结果所述，肾癌细胞中Notch1表达显著高于HK- 2细胞，提示Notch1在肾癌组织中可能起着促癌作用。本研究结果表明肾癌细胞Caki- 1中Notch1表达下调后能显著降低细胞活力，并诱导细胞凋亡；同时，Transwll侵袭实验结果也证实siRNA Notch1能显著抑制Caki- 1细胞侵袭能力，与siRNA Notch1在头颈部鳞状细胞癌〔8〕、乳腺癌〔9〕中的作用一致。

细胞的凋亡与增殖受凋亡相关基因的严格调控，其中最常见的是Bcl- 2家族。Bcl- 2是此家族中研究最广泛的抑凋亡蛋白，能与促凋亡蛋白Bax形成异二聚体，进而阻断凋亡信号，促进细胞存活。而Bax能自身形成二聚体，将凋亡信号传递给Caspase家族，最终导致细胞凋亡。研究已经表明肾癌组织中Bcl- 2高表达，而Bax低表达甚至缺失〔10〕。另外，肿瘤细胞侵袭的关键步骤之一是细胞外基质降解，以便于肿瘤细胞快速进出，而蛋白水解酶MMPs能够降解大部分的细胞外基质降解。其中MMP2具有双重功能，既能够降解细胞外基质成分，还能够诱导新生血管的生成，最终导致肿瘤细胞的迁移浸润。MMP9是分子量最大的MMPs，几乎能够降解所有的细胞外基质成分，且肾癌组织中MMP2及MMP9阳性率显著高于癌旁组织〔11〕。有研究表明siRNA Notch1能显著调控Bcl- 2家族蛋白表达，并下调MMPs表达，进而抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭等生物学行为〔9〕。本研究结果表明siRNA Notch1能显著下调Bcl- 2、MMP2及MMP9表达、上调Bax表达，提示siRNA Notch1能通过调控Bcl- 2家族蛋白及MMPs蛋白进而抑制肾癌细胞的恶性生物学行为。

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〔2017- 05- 21修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

付宏伟(1978- )，男，副主任医师，主要从事脊柱、创伤研究。

尚春香(1976- )，女，硕士，副主任医师，主要从事肿瘤化疗研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3645- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.003

1 青海省第五人民医院骨科