刘菲菲 李晨光 孙大鹏 张凤香

(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121001)

·基础研究·

Tim- 3通过胆固醇酯水解酶影响巨噬细胞泡沫化过程的机制

刘菲菲 李晨光 孙大鹏 张凤香

(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121001)

目的 观察Tim- 3是否通过调节巨噬细胞内胆固醇脂水解酶(CEH)的表达干扰泡沫化细胞的形成，进而影响动脉粥样硬化的发生发展。方法 Western印迹检测CEH蛋白的表达；液体闪烁计数测定THP- 1 巨噬细胞内胆固醇流出情况；HPLC检测胞内脂质含量；油红O染色显示胞内脂滴情况；ELISA检测肿瘤坏死因子(TNF)- α、MIF、白细胞介素(IL)- 10的分泌情况。结果 Ad- Tim- 3组细胞中CEH的表达被明显抑制，胞内胆固醇流出减少，胞内总胆固醇(TC)、胆固醇酯(CE)及游离胆固醇(FC)的含量明显增加，TNF- α和MIF分泌增多，IL- 10的分泌减少；Ad- CEH组和Ad- Tim- 3+Ad- CEH组细胞中CEH的表达水平被明显增强，胞内胆固醇流出增加，胞内TC、CE及FC的含量明显减少，TNF- α和MIF分泌减少，IL- 10分泌增多。结论 Tim- 3可以通过增强巨噬细胞内CEH的活性抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化。

胆固醇酯水解酶；巨噬细胞；Tim- 3

Tim是一组表达在巨噬细胞表面的受体蛋白家族，Tim- 3是TIM家族成员之一，属于适应性免疫反应的负调控分子，早期研究发现Tim- 3主要在Th1细胞上表达，与炎症性疾病的发病有关，可通过调节单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞的活性干扰动脉粥样硬化(AS)等炎症性疾病的发生发展过程〔1，2〕。胆固醇酯水解酶(CEH)又叫胆盐刺激脂酶，在AS斑块发生发展过程中起重要作用。它能催化胆固醇酯(CE)水解为游离胆固醇(FC)，降低斑块内纤维组织含量，减少CE在细胞内聚积，抑制巨噬细胞形成和T细胞浸润〔3，4〕。本研究主要探讨Tim- 3对巨噬细胞上CEH表达的调节作用及向泡沫细胞转化的可能机制，进而为AS的防治提供新靶点和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人单核巨噬细胞THP- 1(上海生命科学研究院); ox- LDL(北京生物技术有限公司)；鼠抗人CEH抗体、鼠抗人Tim- 3抗体(上海生工)；小鼠抗β- actin抗体、山羊抗鼠 IgG (中杉金桥公司)；ECL发光试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒(凯基生物科技发展有限公司)。

1.2 细胞培养、泡沫化处理 将人THP- 1细胞以每孔1.0×106个细胞接种在含有10%胎牛血清(FBS)，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基的六孔板中，在 37℃，5%CO2培养箱中孵育。加入100 ng/ml佛波醇12肉- 豆蔻酸酯13- 乙酸酯(PMA)，作用72 h，细胞分化成巨噬细胞。在50 mg/ml ox- LDL， 0.3%牛血清白蛋白(BSA)的无血清RPMI 1640培养基中共同孵育48 h，巨噬细胞转化成泡沫细胞。实验分为Control组、Ad- CEH组、Ad- Tim- 3+Ad- CEH组、Ad- Tim- 3组，按分组分别作用各组泡沫细胞48 h。

1.3 油红O染色 培养的巨噬细胞，PBS洗涤1次，4%多聚甲醛脱水- PBS中固定10 min。60%异丙醇漂洗，用0.3%油红O在60%异丙醇中染色巨噬细胞10 min，再用60%异丙醇洗涤; 然后用苏木精复染巨噬细胞3 min。 用水充分洗涤后，用显微镜以400倍放大倍数拍摄巨噬细胞。

1.4 胆固醇流出测定 培养上述细胞，然后用0.2 μCi/ml〔3H〕胆固醇标记。 72 h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，并在含有0.1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的RPMI 1640培养基中孵育过夜，使所有细胞库中的〔3H〕胆固醇平衡。 平衡的〔3H〕胆固醇标记的细胞用PBS洗涤，并在含有RPMI 1640培养基和0.1%BSA的2 ml流出培养基中孵育。 在指定的时间获得150 μl流出介质样品，并通过0.45 μm过滤器除去任何浮动细胞。 单层在PBS中洗涤2次，并用异丙醇提取细胞脂质。 然后通过液体闪烁计数测量培养基和细胞相关的〔3H〕胆固醇。 通过公式计算流出百分比：〔总培养基计数/(总细胞计数+总培养基计数)〕×100%。

1.5 HPLC分析 细胞用PBS洗涤3次。 将0.5%NaCl加入约50～200 μg细胞蛋白/ml。 使用超声处理器将细胞超声处理2 min。 使用BCA试剂盒测量细胞溶液中的蛋白质浓度。 使用0.1 ml等分试样细胞溶液(含有5～20 μg蛋白质)测量FC，另一等分试样用于总胆固醇(TC)检测。 FC溶于异丙醇(1 mg胆固醇/ml)，储存于-20℃备用。蛋白沉淀，并在15℃下以1 500 r/min离心10 min。 将10 μl上清液样品应用于HLPC柱。使用异丙醇∶正庚烷∶乙腈(35∶13∶52)以1 ml/min的流速洗脱柱8 min。

1.6 Western印迹检测相关蛋白的表达 细胞溶液作用48 h后，冷PBS清洗2次，提取细胞总蛋白，按照试剂盒说明书用BCA法定量。电泳分离后通过电转仪将凝胶上的蛋白样品移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉在37℃封闭2 h。分别加入1∶500 Tim- 3抗体、 1∶1 000 CEH单克隆抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入山羊抗鼠 IgG (1∶200)缓冲液，4℃孵育2 h。洗膜3次后凝胶成像。

1.7 ELISA法检测细胞因子的分泌情况 具体步骤均按照ELISA试剂盒说明操作。诱导后泡沫细胞接种于24孔板中，按照每孔2×105个细胞PMA的培养液培养72 h后，PBS洗3遍，在分组处理48 h后收集各组细胞的培养液。揭去封板膜后室温孵育30 min，期间配置洗涤液，洗涤液洗涤后弃去、甩干，重复5次。最后加入显色剂，15 min后加入终止液终止，酶标仪450 nm波长顺序测定各孔吸光度(OD值)。

1.8 统计学方法 应用SPSS13.0软件，所有数据均采用ANOVA方法进行处理，计量资料分析采用t检验，计数资料分析采用χ2检验。

2 结 果

2.1 Tim- 3对巨噬细胞内CEH表达的影响 与Control组(93.231±2.129)比较，Ad- Tim- 3组巨噬细胞内CEH的表达(50.736±2.706)被明显抑制，而Ad- Tim- 3+Ad- CEH组(127.023±5.895)和Ad- CEH组(126.442±5.561)巨噬细胞内CEH的表达均被明显增强(P<0.05)。见图1。

图1 Ad- Tim- 3和Ad- CEH对巨噬细胞中CEH表达的影响

2.2 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH对巨噬细胞泡沫化的影响 各组作用细胞48 h后，油红O染色结果显示，Control组细胞阳性率为45.76%±2.95%；Ad- Tim- 3组细胞阳性率为67.82%±4.02%；Ad- Tim- 3+Ad- CEH组细胞阳性率为26.31%±2.12%；Ad- CEH组细胞阳性率为27.26%±2.87%。

2.3 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH对巨噬细胞内胆固醇流出的影响 Control组胆固醇流出(9.25±0.41),Ad- Tim- 3组明显抑制胆固醇流出(6.24±0.25)；而Ad- Tim- 3+Ad- CEH组(16.11±0.30)和Ad- CEH组(14.76±0.53)显著增加巨噬细胞胆固醇流出。

2.4 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH对巨噬细胞脂质蓄积的影响 与Control组比较，Ad- Tim- 3组细胞内CE、FC、TC含量均明显增加(P<0.05)；而Ad- Tim- 3+Ad- CEH组和Ad- CEH组细胞内CE、FC、TC含量明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 HPLC分析各组胆固醇代谢结果

与Control组比较：1)P<0.05

2.5 Ad- Tim- 3和(或)Ad- CEH对巨噬细胞上清液中细胞因子分泌的影响 与Control照组比较，Ad- Tim- 3组细胞上清中TNF- α和MIF的分泌均明显增多，而IL- 10的分泌均被明显抑制(P<0.05)；Ad- Tim- 3+Ad- CEH组和Ad- CEH组细胞上清中TNF- α和MIF的分泌被明显抑制，而IL- 10的分泌明显增多(P<0.05)。 见图2。

与Control组比较：1)P<0.05 图2 Ad- Tim- 3和Ad- CEH对THP- 1 巨噬细胞上清中TNF- α、MIF、IL- 10分泌的影响

3 讨 论

巨噬细胞是AS形成的主要效应细胞，其影响AS形成的机制是通过吞噬血液中的大量脂质形成泡沫细胞，而形成的泡沫细胞继续聚集脂质，不断大量蓄积的脂质又可以进一步导致细胞内炎症因子分泌增加，而分泌的炎症因子可进一步加速AS的形成〔5〕。

Tim- 3表达在CD4+Th1细胞上,可调节Th1细胞反应，在自身免疫性疾病、AS、抗感染等中发挥一定作用〔6，7〕。另外，Tim- 3可促进TNF- α、IL- 6分泌及调节巨噬细胞共刺激分子表达，即影响炎症介质如 TNF- α、MIF、IL- 10的释放〔8〕。研究已经发现〔9，10〕，CEH在AS的形成过程中起到十分重要的作用，CEH的表达水平与AS的易感性呈负相关。本研究结果发现，高表达的Tim- 3可以明显抑制巨噬细胞内CEH的表达，但当CEH的表达被增强时Tim- 3的这种抑制作用不再存在。进一步研究发现，增加Tim- 3的表达可以进一步加强巨噬细胞向泡沫细胞的转化，增加CE在巨噬细胞内的聚集，减少 FC 的流出。但当增强CEH的表达时Tim- 3的这种促进泡沫细胞形成和抑制胆固醇外流的作用却被明显降低。同时还发现，Tim- 3可以通过调节巨噬细胞内CEH的表达来影响TNF- α、MIF和IL- 10细胞因子的分泌，进而进一步影响AS的形成与发展。

综上，Tim- 3可能是通过抑制巨噬细胞内CEH的表达，减少巨噬细胞内胆固醇流出，促进胞内脂质蓄积来影响AS病变的发生发展。但其在 AS 形成过程中的作用还需进一步研究。

1 Monney L,Sabatos CA,Gaglia JL,etal.Th1- specific cell surface protein Tim- 3 regulates macrophage activation and severity of an autoimmune disease〔J〕.Nature,2002;415(6871):536- 41.

2 Zhao Z,Jiang X,Kang C,etal.Blockade of the T cell immunoglobulin and mucin domain protein 3 pathway exacerbates sepsis- induced immune deviation and immunosuppression〔J〕.Clin Exp Immunol,2014;178(2):279- 91.

3 Bandyopadhyay S,Long ME,Allen LA.Differential expression of microRNAs in Francisella tularensis- infected human macrophages:miR- 155- dependent downregulation of MyD88 inhibits the inflammatory response〔J〕.PLoS One,2014;9(10):e109525.

4 Wang J,Yu F,Jia X,etal.MiR- 155 deficiency enhances the recruitment and functions of myeloid- derived suppressor cells in tumor microenvironment and promotes solid tumor growth〔J〕.Int J Cancer,2015;136(6):E602- 13.

5 Mc Laren JE,Michael DR,Ashlin TG,etal.Cytokines,macrophage lipid metabolism and foam cells: implications for cardiovascular disease therapy〔J〕.Prog Lipid Res,2011；50:331- 47.

6 Zhang XM,Shan NN,Sun M,etal.Imbalanced expression of human Tim- 1 and Tim- 3 in peripheral blood mononuclear cells from immune thrombocytopenia patients〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;19(1):1- 4.

7 Yong QC,Jun PR,Juan Z,etal.MiR- 155 regulates interferon- c production in natural killer cells via Tim- 3 signalling in chronic hepatitis C virus infection〔J〕.Immunology,2015;145,485- 97.

8 Rangachari M,Zhu C,Sakuishi K,etal.Bat3 promotes T cell responses and autoimmunity by repressing Tim- 3 - mediated cell death and exhaustion〔J〕.Nat Med,2012;18(9):1394- 400.

9 Sakai K,Igarashi M,Yamamuro D,etal.Critical role of neutral cholesteryl ester hydrolase 1 in cholesteryl ester hydrolysis in murine macrophages〔J〕.J Lipid Res,2014;55(10):2033- 40.

10 Bie J,Wang J,Yuan Q,etal.Liver- specific transgenic expression of cholesteryl ester hydrolase reduces atherosclerosis in Ldlr- /- mice〔J〕.J Lipid Res,2014;55(4):729- 38.

〔2017- 01- 17修回〕

(编辑 李相军)

国家自然科学基金(81541099);辽宁省自然科学基金(2016010330- 301)

张凤香(1978- )，女，博士，副主任医师，副教授，硕士生导师，主要从事动脉粥样硬化研究。

刘菲菲(1982- )，女，硕士，医师，主要从事动脉粥样硬化研究。

R33

A

1005- 9202(2017)15- 3641- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.001