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我国五省(市)小麦粉中重要镰刀菌毒素的污染调查

2017-08-16韩小敏李凤琴徐文静张宏元张靖赵熙徐进韩春卉

中国猪业 2017年6期
关键词:五省小麦粉限量

韩小敏李凤琴徐文静张宏元张靖赵熙徐进韩春卉*

(1国家食品安全风险评估中心卫生部食品安全风险评估重点实验室,北京100021;2四川大学华西公共卫生学院营养与食品卫生学系,四川成都610041)

我国五省(市)小麦粉中重要镰刀菌毒素的污染调查

韩小敏1李凤琴1徐文静2张宏元1张靖1赵熙1徐进1韩春卉1*

(1国家食品安全风险评估中心卫生部食品安全风险评估重点实验室,北京100021;2四川大学华西公共卫生学院营养与食品卫生学系,四川成都610041)

调查我国安徽省、北京市、河南省、吉林省、山东省五省(市)158份小麦粉中单端孢霉烯族化合物和玉米赤霉烯酮(zeara l enone,ZEN)等10种重要镰刀菌毒素的污染情况。样品经乙腈-水(84∶16,V∶V)提取、Mu l t i Sep 226多功能净化柱净化后,分别以含2 mmo l/L甲酸铵的0.1%甲酸-甲醇和含0.1%氨水-乙腈作为电喷雾正离子模式和负离子模式检测小麦粉样品的10种重要镰刀菌毒素。结果显示:我国五省(市)小麦粉易受B类单端孢霉烯族化合物和ZEN的污染。其中B类单端孢霉烯族化合物以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxyniva l eno l,DON)的污染最为严重,超出限量标准1 000μg/kg的样品百分比为68%(108/158),阳性样品中DON的平均含量为4 084.8μg/kg;同时还检出3-乙酰基-DON(3-acet y l-DON,3-A-DON)、15-乙酰基-DON(15-acet y l-DON,15-A-DON)及其隐蔽型DON-3-葡萄糖苷(DON-3-g l ucoside,DON-3-G)。ZEN的超出国家限量标准的百分比为24%(38/158),平均含量为85.8μg/kg。本研究表明我国五省(市)小麦粉受DON和ZEN污染严重,需要加强对其的持续监测。

镰刀菌毒素;小麦粉;高效液相色谱-串联质谱

镰刀菌毒素是镰刀菌属(Fusarium sp.)的某些种在特定条件下产生的有毒次级代谢产物的总称,是造成植物萎蔫、根腐、穗腐,导致农作物减产的重要因子,同时也是人畜摄入后引起人畜中毒的重要病因[1]。据报道,镰刀菌属真菌产生的毒素种类多样,目前国际上普遍关注的毒素主要包括单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)等。天然污染谷物和饲料的单端孢霉烯族化合物主要包括A类和B类,前者代表性的毒素有T-2毒素、HT-2毒素、二乙酰草镰刀菌烯醇(d iacetoxyscirpenol, DAS),后者代表性的毒素有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol, NIV)及其衍生物3-乙酰基-DON(3-acetyl-DON, 3-A-DON)、15-乙酰基-DON(15-acetyl-DON, 15-A-DON)和其隐蔽型DON-3-葡萄糖苷(DON-3-g lucoside,DON-3-G)[2-4]。此外,某些产生DON的镰刀菌在特定条件下还可产生具有雌激素样作用的非固醇类有毒代谢产物ZEN[5]。

本课题组前期对我国2007—2008年产192份小麦粉的污染调查发现,DON及其衍生物和ZEN为污染的主要真菌毒素,88%(169/192)的小麦粉样品中检出DON(范围:1.5~590.7μg/kg,中位数:30.08μg/kg),22.9%(44/192)的小麦粉样品呈现ZEN阳性(范围:1.7~3 425.0μg/kg,中位数:8.0μg/kg)[6],其中6份样品中ZEN含量超过我国规定的限量标准(60μg/kg)。熊凯华等[7]采用酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)和高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatog raphy,HPLC)对安徽、河南两省小麦中DON和ZEN的测定发现,两省小麦样品中DON和ZEN的污染严重,两种毒素的平均含量分别为425.5±545.6μg/kg和152.4±336.4μg/kg,分别有10.8%和38.6%的样品中DON和ZEN含量超过国家限量标准(DON:1 000μg/kg,ZEN:60μg/kg)。白艳艳等[8]发现厦门2013年市售散装小麦粉中DON的检出率为95%,高于预包装小麦粉。

综上可见,我国小麦粉受镰刀菌毒素污染严重,但目前研究大多针对一种或两种毒素的污染情况进行检测。考虑到不同镰刀菌毒素的毒性之间可能存在协同作用,有必要对多种镰刀菌毒素的污染状况进行协同检测。因此本试验采用灵敏度高、特异性强、可同时对多种毒素进行定性及定量检测的高效液相色谱-串联质谱法(high-performance liquid chromatog raphy tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)对我国五省(市)小麦粉中10种重要镰刀菌毒素的污染情况进行检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Prom inence LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司);Trip le QuadTM3500质谱仪(美国AB Sciex公司);超声波清洗器(无锡超声电子设备厂);自动涡旋混合器(美国Beckman公司);纯水仪(美国Millipore公司);氮吹仪(美国Organomation公司);多功能振荡器(江苏金坛医疗仪器厂)。

1.2 试剂与材料

T-2毒素(浓度为100.5μg/m L)、HT-2毒素(浓度为100.4μg/m L)、3-A-DON(浓度为100.7μg/m L)、15-A-DON(浓度为101.1μg/m L)、NIV(浓度为104.4μg/m L)、镰刀菌烯酮-X(Fusarenon X,FX,浓度为100.3μg/m L)、DAS(浓度为100.8 μg/m L),DON-3-G、DON和ZEN为固体标准品(奥地利Romer Labs)。

甲醇、乙腈(色谱纯)均购自美国Fisher公司;甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氨水(色谱纯)均购自美国Sigma公司;冰醋酸(分析纯)购自北京化学试剂公司。MultiSep 226多功能净化柱(奥地利Romer Labs);0.22μm尼龙滤膜(天津津腾实验设备有限公司)。

1.3 样品信息

小麦粉样品分别于2013年购自安徽省、北京市、河南省、吉林省、山东省五省(市)的超市及农贸市场,具体样品信息见表1。

表1 小麦粉样品信息列表

1.4 真菌毒素标准溶液的配制

真菌毒素混合标准储备液:取一定量真菌毒素标准溶液于棕色小瓶中,用乙腈稀释后,制备成混合标准储备溶液,使T-2、3-A-DON、15-A-DON、DON-3-G、NIV、FX、DAS各毒素的浓度均为10μg/m L,ZEN的浓度为5μg/m L,DON和HT-2的浓度为30μg/m L,并于-18℃避光保存备用。

使用前将混合标准储备液用乙腈-水(50∶50,V/V)或空白小麦粉提取液逐级稀释,配制成不同浓度的毒素标准工作液和基质匹配毒素标准工作液。

1.5 样品前处理

参考李凤琴等[9]建立的方法并进行适当改进,振荡提取、过滤后取8 m L滤液,加入40μL冰醋酸(相当于添加0.5%冰醋酸)再过MycoSep 226净化柱进行净化,以提高ZEN、3-A-DON、15-A-DON等真菌毒素的回收率,其他步骤未作改动。

1.6 仪器条件

1.6.1 质谱条件

采用电喷雾多反应监测(multip le reactionmonitoring,MRM)模式进行信号采集,经过优化后10种重要镰刀菌毒素的主要质谱参数见表2。电喷雾正离子模式(electrosp ray positive ionizationmode,ESI+)和电喷雾负离子模式(elec trosp ray negative ionization mode, ESI-)的离子化电压分别为+5 500 V和-4 500 V。ESI+与ESI-的气帘气、离子源温度、喷雾气、辅助加热气、碰撞气、驻留时间等参数均相同,分别为35 psi、550℃、55 psi、50 psi、6 psi、20ms[9]。

表2 1 0种真菌毒素的主要质谱参数

1.6.2 色谱条件

优化后的色谱条件如下,色谱柱:Waters ACQUITY BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,粒径1.7 μm);柱温:40℃;样品室温度:4℃;进样体积:5 μL;流速:0.3m L/m in。ESI+条件下的流动相A为含2 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸溶液,流动相B为甲醇;ESI-条件下的流动相A为0.1%氨水溶液,流动相B为乙腈。ESI+洗脱程序:0~0.5m in 55%A,0.5~6m in 55%A~20%A,6~8m in 20%A~5%A,8~11m in 5% A,11~11.1m in 5%A~55%A,11.1~14m in 55%A。ESI-洗脱程序:0~0.5m in 95%A,0.5~5m in 95%A~35%A,5~6m in 35%A~5%A,6~7m in 5%A,7~7.5 m in 5%A~95%A,7.5~11.5m in 95%A[9]。

1.7 数据处理

采用SPSS 19.0对158份小麦粉样品中的真菌毒素含量进行处理和统计分析,分别计算小麦粉样品中10种重要镰刀菌毒素含量的最大值、最小值、平均值、检出率等关键参数。

2 结果与讨论

2.1 小麦粉中10种重要镰刀菌毒素检测的关键方法学参数

在保证小麦粉中各真菌毒素回收率和相对标准偏差均满足欧盟Comm ission Regulation(EC)No 401-2006规定的对食品中T-2、HT-2、DON、ZEN等真菌毒素的回收率及相对标准偏差定量测定要求的基础上进一步对测定方法进行验证[10]。从表3可知,小麦粉中A类单端孢霉烯族化合物(T-2、HT-2和DAS)、B类单端孢霉烯族化合物(DON、DON-3-G、3-A-DON、15-A-DON、NIV、FX)和ZEN的线性范围分别为0.75~1 500μg/kg、0.5~1 000μg/kg和0.5~500μg/kg。小麦粉中A类单端孢霉烯族化合物、B类单端孢霉烯族化合物和ZEN的检出限(Lim it of Determ ination,LOD,S/N≥3)和定量限(Lim it of Quantification,LOQ,S/N≥10)范围分别为10~10.9 μg/kg和33~36μg/kg、0.4~33.1μg/kg和1.4~110.5μg/kg、12.8μg/kg和42.6μg/kg。且10种重要镰刀菌毒素的线性相关系数均大于0.99,线性关系良好,可满足小麦粉中真菌毒素定量检测的要求。

2.2 小麦粉中重要镰刀菌毒素污染状况

经统计分析可知,小麦粉样品中污染的毒素主要为B类单端孢霉烯族化合物和ZEN,所测小麦粉样品中均未检出A类单端孢霉烯族化合物的T-2和DAS以及B类单端孢霉烯族化合物的FX,仅来自河南省和吉林省的2个小麦粉样品中检出了HT-2毒素(含量均为36.6 μg/kg),且各省份样品还被3种衍生物DON-3-G、3-A-DON、15-A-DON和NIV污染。

表3 小麦粉中真菌毒素检测的方法学参数

表4 我国五省(市)小麦粉中DON、DON-3-G、3-A-DON、15-A-DON、NIV和ZEN的污染调查

从表4可知,在所测的158份小麦样品中,DON的污染最为严重,84%(132/158)的样品中检出DON(阳性样品的平均值:4 084.8μg/kg,范围:23.5~25 375μg/kg);其次为3-A-DON和15-A-DON,两者的阳性率、平均污染水平分别为84%(132/158)和61%(97/158)、14.9μg/kg和14.7μg/kg;再次为DON-3-G和NIV,两者的阳性率和平均污染水平分别为24%(38/158)和22%(35/158)、13.9μg/kg和26.9μg/kg。77%(121/158)的小麦粉样品中检出ZEN,其平均污染水平为85.8μg/kg,超过食品安全国家标准真菌毒素限量标准规定的60μg/kg的要求[11]。

从地区分布看,DON的污染严重程度从高到低依次为河南省(平均值:6 526.8μg/kg,范围:23.5~25 375μg/kg)>安徽省(平均值:4 845.3μg/kg,范围:1 550~12 875μg/kg)>北京市(平均值:4 457.7 μg/kg,范围:356.3~14 875μg/kg)>山东省(平均值:2 674.2μg/kg,范围:157.5~10 225μg/kg)>吉林省(平均值:2 304.4μg/kg,范围:197.5~6 312.5μg/kg)。ZEN的污染严重程度从高到低依次为吉林省(平均值:115.5μg/kg,范围:13.0~810.0μg/kg)>山东省(平均值:100.5μg/kg,范围:14.4~1 018.8μg/kg)>北京市(平均值:94.4μg/kg,范围:19.8~617.5μg/kg)>安徽省(平均值:45.3μg/kg,范围:15.1~151.3μg/kg)>河南省(平均值:64.2 μg/kg,范围:13.9~438.8μg/kg)。

表5 中国五省(市)小麦粉DON和ZEN超标情况分析

2.3 中国五省(市)小麦粉中DON和ZEN污染水平与中国和欧盟真菌毒素限量标准对比分析

DON又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol),和ZEN均由镰刀菌属(Fusarium)真菌产生。人尤其是儿童如食用了被DON污染的食物可导致呕吐、腹泻等疾病[12-13]。ZEN具有一定的类雌激素作用,有研究表明ZEN可能与性早熟和宫颈癌变有关[14]。《GB 2761-2011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》[11]和欧盟(EU)No 165/2010[15]中分别规定了直接供人类食用的谷物、谷物淀粉、在市场上销售的供人类直接食用的糠(作为终产品)和小麦、小麦粉中DON和ZEN的限量分别为1 000μg/kg和60μg/kg(中国)、750 μg/kg和75μg/kg(欧盟)。从表5可知,68%(108/158)和70%(111/158)的小麦粉样品中DON的含量分别超过了我国真菌毒素限量1 000μg/kg和欧盟真菌毒素限量750μg/kg的要求。24%(38/158)和16%(26/158)的小麦粉样品中ZEN的含量分别超过了我国真菌毒素限量60μg/kg和75μg/kg的要求。

2.4 小麦粉中重要镰刀菌毒素的相关性分析

据已有文献报道,镰刀菌属的某些种如禾谷镰刀菌(F.g ram inearum,其有性阶段为玉米赤霉Gibberella zeae)和黄色镰刀菌(F.culmorum)等在特定条件下可同时产生多种不同类型的镰刀菌毒素,如A类单端孢霉烯族化合物、B类单端孢霉烯族化合物和ZEN[16]。因此有必要对样品中不同真菌毒素间的相关性进行分析。本文中采用Spearman's相关性分析对158份小麦粉样品中10种重要镰刀菌毒素的污染情况进行分析,从表6可知,DON和3-A-DON、DON和ZEN、3-A-DON和NIV、ZEN和NIV的污染水平之间具有显著相关性,即DON污染水平较高的样品可能同时伴随有3-ADON、ZEN的污染;ZEN污染水平较高的样品可能伴随有NIV的污染,提示需要关注多种真菌毒素的协同污染。本结果与DON、3-A-DON、ZEN可由同一株镰刀菌产生的现象相吻合。

表6 中国五省(市)小麦粉中重要真菌毒素的相关性分析

3 结论

据联合国粮农组织报道,全球每年约有25%的农作物被真菌毒素污染,约2%的农作物因污染严重而失去营养和经济价值,造成数千亿美元的经济损失[17]。其中镰刀菌属的多种真菌如禾谷镰刀菌(Fusarium g ram inearum)、三线镰刀菌(F.tricinctum)、梨孢镰刀菌(F. poae)、串珠镰刀菌(F.monilifore)产生的单端孢霉烯族化合物和ZEN等真菌毒素是引起谷物污染和人畜中毒的重要毒素。因此,世界各国建立了相应的真菌毒素限量标准以确保谷物的食用安全。

本试验在前期对我国小麦样品中真菌毒素污染调查的基础上,选择了镰刀菌毒素污染相对严重的安徽省、北京市、河南省、吉林省、山东省五省(市)的小麦粉样品进行分析。结果表明,五省(市)小麦粉样品DON和ZEN超标严重,分别有68%(108/158)和24%(38/158)小麦粉样品中DON和ZEN的含量超过了我国真菌毒素限量DON 1 000μg/kg和ZEN 60μg/kg的要求[11],明显高于熊凯华等[7]对安徽省和河南省两省小麦粉样品中DON和ZEN污染情况的调查,两省样品中有10.8%的样品DON超标、38.6%的样品ZEN超标;也显著高于本实验室前期对中国2008—2011年24省小麦及其制品中DON的污染调查,该调查中DON的超标率为1.3%(9/697)[18]。

值得注意的是,本次调查中还检出了DON及其衍生物3-A-DON和15-A-DON和其隐蔽型DON(DON-3-G),各毒素的平均污染水平和含量范围分别为14.9μg/kg和10.6~177.5μg/kg、14.7μg/kg和13.4~23.5μg/kg、13.9μg/kg和8.7~33.3μg/kg。王伟等[19]对中国谷物制品中DON、ZEN、NIV三种毒素的膳食暴露评估研究表明,儿童对3种真菌毒素的膳食暴露量均高于成人,是膳食暴露DON、NIV和ZEN的高危人群。长期摄入DON、ZEN高污染水平的小麦粉和玉米制品对健康造成危害的风险也较高。同时2010年4月,CAC第四届会议同意通过了食品法典委员会提出的制定谷物及谷物产品中呕吐毒素及其乙酰化物的最大限量要求,制定DON及衍生物的限量标准已经提上CAC日程[20]。提示有必要对我国现行的DON限量标准进行修订,目前最新修订的食品安全国家标准已经将针对单一DON的检测改为DON及其衍生物的检测。该标准的实施将有助于推动我国食品安全真菌毒素限量标准DON及其衍生物的制定。

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NaturalOccurrence of ImportantMycotoxins Produced by Fusarium in Wheat Flour from Five Provinces in China

HAN Xiaom in1,XUWenjing2,ZHANG Hongyuan1,ZHANG Jing1,ZHAO Xi1,XU Jin1,LIFengqin1*
(1Key Lab of Food Safety Risk Assessm ent of Ministry o f Health,China National Centre for Food Safety Risk Assessm ent,Beijing Chaoyang 100021,China;2SchoolofHuaxiPub lic Hea lth,Sichuan University,Chengdu 610000,China)

To elucidate the natural occurrence of 10 kinds of im portantm ycotoxins p roduced by Fusarium inc lud ing trichothecenes and zearalenone(ZEN)in 158 wheat flour samp les collec ted from five p rovinces Anhui,Beijing,Henan,Jilin, Shandong.Sam p les were extracted w ith acetonitrile-water(84:16,V:V)followed by c lean-up w ith MultiSep 226 multifunctionalcolumn.The electrosp ray positive ionizationmode(ESI+)and electrosp ray negative ionizationmode(ESI-)was em p loyed to acquire the signaland detect the 10 kinds of im portantmycotxins p roduced by Fusarium using the mobile phase for ESI+:0.1%form ic acid containing 2mmol/L ammonium formate-methanoland ESI-:0.1%ammonia water-acetonitrile.Results show that the wheat flour samp les collected from the five p rovinces in China were easy to be contam inated by type B trichothecenes and ZEN.DON was themostseriously contam inated type B trichothecenes and the rate for those higher than the tolerance lim it1 000μg/kg was 68%(108/158)and the average concentration for the positive samp les was 4 084.8μg/kg.At the same time,3-acetyl-DON(3-ADON)and 15-acetyl-DON(15-ADON)and the masked m ycotoxin DON-3-g lucoside(DON-3-G)were also detected in the wheat flour samp les.The rate for those higher than the tolerance lim it 60μg/kg was 24%(38/158)and the average concentration for positive sam p les was 85.8μg/kg for ZEN.The wheatsamp les collec ted from five p rovinces in China were seriously contam inated by DON and ZEN and continuouslymonitoring for thesemycotoxins is necessary.

Fusarium m ycotoxin;wheat flour;liquid chromatography tandem mass spectrometry

R155.51

A

1673-4645(2017)06-0033-07

2017-04-12

北京市自然科学基金(7163235);科技基础工作专项(2013FY113400)

韩小敏(1983-),女,副研究员

*通讯作者:韩春卉,女,主任技师,hanchunhui@c fsa.net.cn

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