吴永琴， 王志恒， 高 晶， 陈慧芬， 唐振华， 应春妹

外阴阴道念珠菌病患者耐氟康唑白念珠菌克隆流行分析

吴永琴1， 王志恒1， 高 晶1， 陈慧芬2， 唐振华3， 应春妹1

目的 探讨上海地区外阴阴道念珠菌病的菌种分布及其主要致病菌的分子流行特点，并进行菌株遗传进化分析。方法 收集 2015 年 8 月至 2016 年 2 月复旦大学附属妇产科医院、上海市第一妇婴保健院及国际和平妇幼保健院 3 所医院外阴阴道念珠菌病患者分离得念珠菌共 2 185 株，进行菌种鉴定及统计分析，并采用 ATB FUNGUS 3 试剂盒检测抗真菌药物体外最低抑菌浓度，对其主要致病菌运用多位点序列分型（MLST）的方法进行分子分型，同时应用 eBURST 和 MEGA 6.0 软件进行遗传进化分析。结果 2 185 株念珠菌属中共鉴定出白念珠菌 1 988 株，光滑念珠菌 149 株，热带念珠菌 20 株，其他念珠菌 28 株 ；白念珠菌对氟康唑耐药率为 6.5% ；93 株白念珠菌共检测出 26 个二倍体序列型（DST），其中 50 株敏感菌序列型为分散分布，而 43 株耐氟康唑白念珠菌集中于同一个克隆复合体（CC 69），并处于同一个进化树分枝上（Clade 1）。结论 白念珠菌是上海地区3所妇产科医院外阴阴道念珠菌病的主要致病菌，对三唑类药物的耐药率较高，而且耐氟康唑白念珠菌表现为 CC 69 的克隆传播流行，需要进行重点监控。

外阴阴道念珠菌病 ； 白念珠菌 ； 多位点序列分型 ； 克隆流行

外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是由念珠菌属感染引起的一种常见的妇科疾病。流行病学研究表明，约 75% 育龄女性一生中至少会感染 1 次 VVC，而且其中约 5%～8% 的女性会遭受复发性 VVC 的困扰[1]。念珠菌属是女性阴道的正常寄生菌，当阴道局部微环境发生变化，机体免疫力低下时，念珠菌属就会过度繁殖，进而发展为 VVC。本研究就上海3所妇产科专科医院送检阴道分泌物标本进行培养及药敏试验，分析VVC的菌种分布以及念珠菌属的耐药性，为临床诊治VVC提供帮助。

白念珠菌是VVC患者的主要临床分离菌，对白念珠菌进行基因分型对了解其分子流行特点和指导临床防治具有重要意义。目前，主要的分子分型方法包括多位点序列分型（multilocus sequence typing， MLST）、脉冲场凝胶电泳、微卫星长度多态性、随机扩增片段长度多态性及限制性长度多态性等[2-5]。其中 MLST 分型技术因为分辨率高，重复性好及易与国内外比较等优点而得到广泛应用。本研究选取上海3所妇产科专科医院VVC患者中分离的部分敏感和耐药白念珠菌进行分子分型，探讨其流行规律，以便为VVC的诊治提供临床分子流行病学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与鉴定

收集 2015 年 8 月至 2016 年 2 月 VVC 患者分离的念珠菌菌株共 2 185 株，其中 1 223 株来自复旦大学附属妇产科医院，684 株来自上海市第一妇婴保健院，278 株来自国际和平妇婴保健院，所有菌株均分离自患者的阴道分泌物。标本收集后立即接种科玛嘉显色平皿（上海科玛嘉微生物技术有限公司），置于 30 ℃孵育箱中培养 24～48 h。科玛嘉显色平皿上绿色菌落为白念珠菌，紫色为光滑念珠菌，蓝灰色为热带念珠菌，粉红色为克柔念珠菌，白色为其他念珠菌。并采用 API 20C AUX酵母菌鉴定系统（生物梅里埃公司，法国）加以鉴定。所有菌株保存于 25% 甘油 YPD 保存液中，-80 ℃冷冻保存。随机选取 3 所医院鉴定好的 43 株氟康唑耐药株和 50 株氟康唑敏感株进行分子流行分析。

1.2 药敏试验

挑取平皿上的单个菌落，按照法国生物梅里埃公司 ATB FUNGUS 3 试剂盒说明书进行体外抗真菌药物敏感试验，自行判断药敏结果。该试剂盒测试了 5 种抗真菌药物 ：5-氟胞嘧啶、两性霉素 B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑。试验质控菌株为近平滑念珠菌 ATCC 22019 和克柔念珠菌ATCC 6258。药敏结果按照 CLSI M27-S4 折点判断。随机选取的 93株白念珠菌使用微量肉汤稀释法进一步验证药敏结果。

1.3 MLST 分型方法及引物

参照MLST数据库（http：//pubmlst.org/ calbicans/）中给出的7对管家基因序列进行MLST分型，所有引物均来自该数据库。将每个菌株的管家基因序列提交数据库，即可得到对应的等位基因型别，进而确定二倍体序列型（diploid sequence type， DST）。7对管家基因序列引物见表1。

1.4 基因组提取、扩增及测序

将 活化的 菌 种接种 于 YPD 平皿 30 ℃培 养24 h， 挑 取 单 个 克 隆 接 种 至 5 mL YPD 培 养 液 中30 ℃恒温摇床中摇菌 24 h，离心并去上清液，用无菌 PBS 洗 2次，吸净上清液。使用玻璃珠振荡法破壁后，采用酚氯仿法抽提基因组DNA，使用Nanodrop 2000 核酸定量分析仪检测基因组 DNA浓度，用无菌双蒸水稀释至 100 ng /μL。所有 PCR反 应 条 件 参 照 PrimeSTAR® HS DNA Polymerase试剂盒（大连宝生物工程有限公司，中国）说明书。PCR 产物双向测序由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司完成。

1.5 eBURST分析

将 得 到 的 DST 型 及 等 位 基 因 位 点 提 交eBURST v3 在 线 软 件（http ：//eburst.mlst.net/v3/ enter_data/single/），然后进行聚类分析。

1.6 菌株进化关系分析

根据 Odds 等[6]对 1 391 株白念珠菌的 MLST分型及构建进化树的方法，将本次所有DST型别与 已 知 Clade 的 1 005 个 不 同 的 DST 型 别 一 起 分析，使用 MEGA6.0 软件，并采用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA） 及 Bootstrap 的 1 000 次 重 复，从而绘制出系统发育进化树，并得出 Clade 分群。根据 Shin 等[7]建议，以 0.04 作为 p-distance 划分Clade 分枝的阈值。

2 结果

2.1 VVC 的菌种分布和耐药分析

3 所 医 院 VVC 患 者 中 共 分 离 出 2 185 株 念 珠菌 属， 其 中 白 念 珠 菌 1 988 株， 光 滑 念 珠 菌 149株，热带念珠菌 20 株，近平滑念珠菌 15 株，克柔念珠菌 8株，其他念珠菌 5株，见表2。3所医院VVC患者临床分离菌均以白念珠菌为主，其次为光滑念珠菌，菌种分布基本一致。白念珠菌对伊曲康唑耐药率最高，达到 24.5%，对氟康唑也有一定的耐药率。非白念珠菌对三唑类药物耐药率明显高于白念珠菌，见表3。

表1 MLST 分型的 7 对管家基因引物序列Table 1 Seven pairs of housekeeping gene primers for multilocus sequence typing

2.2 白念珠菌MLST 分型

本次共选取 93 株白念珠菌进行 MLST 分型，共发现 26 个 DST 型别，其中 50 株敏感菌检测到了 26 个 DST 型别，而 43 株耐药株仅检测到 5 个DST 型别。在耐药菌株中，75% 的菌株为 DST 79型，其余 4 个 DST 型分别为 DST 435、DST 1867、DST 254 和 DST 1395 ；而敏感菌株序列表现为分散分布，没有检测到主导的序列型。eBURST 分析显示，敏感株 26 个不同的 DST 型分属于 12 个克隆复合体（Clonal Complexes， CC）和 2 个独特型；而耐药株的 5个不同DST型均属于同一个克隆复合体，CC 69。本次检测到的 26 个 DST 型在全球数据库的系统发育进化树分枝上的分布情况见图1。在这 93 株白念珠菌中，敏感株分布在 9个已知的进化树分枝上，而耐药株均聚集在进化枝 1（Clade 1）上。

表2 3所医院念珠菌属菌种分布Table 2 Distribution of Candida species in three hospitals

表3 3所医院念珠菌属对抗真菌药物的耐药率Table 3 Resistance rates of Candida species to antifungal agents in three hospitals（%）

图1 白念珠菌系统发育进化树Figure 1 Phylogenetic tree of Candida albicans

3 讨论

VVC是育龄期女性的常见妇科病，诊断治疗不当，易发展为复发性 VVC，严重影响女性的生殖 健 康。 本 研 究 对 2 185 例 VVC 标 本 进 行 了 培 养与鉴定，结果表明上海地区VVC的致病菌以白念珠菌为主，约占 91%，非白念珠菌以光滑念珠菌为主。国内外流行病学研究显示，VVC的临床分离株以白念珠菌为主，其次是光滑念珠菌[8-10]，与本研究结果一致。VVC分离的白念珠菌及其他念珠菌对抗菌药物的敏感性较高，说明目前的抗真菌药对VVC的致病真菌有良好的抗菌活性，这与国内外的一些研究报道结果一致[11-12]。但也有一部分VVC患者因治疗不当会慢慢发展为复发性VVC，严重影响患者身心健康。需要说明的是，由于商品化试剂检测说明书仍然使用的是 CLSI M27-S3 折点，本研究耐药率统计可能与现行标准判读存在差异。

本研究选取了93株白念珠菌进行MLST分型，共得到 26 个 DST 型，其中 50 株敏感株包含了所有 26 个 DST 型。白念珠菌基因型别具有较大的多样性，目前数据库有三千多个DST型，展现出较强的基因可塑性。国内外研究结果表明不同地区及不同部位分离的白念珠菌都拥有丰富的基因型，并且大部分基因型经 eBURST 分析后分属于不同的克隆复合体[13-15]。Moorhouse 等[16]指出，正是白念珠菌庞大的基因型别，使得白念珠菌在外界环境的选择压力下表现出顽强的生存能力。

43 株耐氟康唑白念珠菌仅检测到 5 个 DST型，其中 DST 79 占 75%，而且所有序列型都属于CC 69 克隆复合体，呈现出耐药株的克隆流行。这与敏感菌株序列型的离散分布明显不同，正如上文所述，三唑类药物的选择压力使得白念珠菌序列型朝着优势序列型方向发展。同时，通过系统发育进化树的绘制，我们也同样发现所有耐药株都处于同一个进化树分枝上（Clade 1）。Odds 等[6]最早将全球数据绘制成系统发育进化图谱，并发现全球流行的菌株主要集中在进化树分枝 Clade 1至 Clade 4。Ge 等[17]证实了阴道分离的白念珠菌基因型别的多样性，与本研究中敏感菌在进化树上表现的多样性分布基本一致。目前还没有关于耐氟康唑白念珠菌在系统发育进化树上独特分布的报道，本研究揭示了其在进化树上集中分布的特点。

综上所述，上海地区VVC的致病菌以白念珠菌为主，且白念珠菌对三唑类药物有一定的耐药率。白念珠菌是一种机会致病性真菌，其基因组可塑性强，在面对环境压力时有很强的适应能力[18]。本研究发现的敏感菌和耐药菌 DST 型不同分布的特点以及耐药菌株的 CC 69 克隆流行趋势也间接验证了这一理论。因此，调查VVC患者的菌种分布及耐药特点可以帮助临床诊治疾病；同时，对白念珠菌的分子分型可以更好地指导临床用药和治疗VVC。

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Clonal dissemination of fluconazole-resistant Candida albicans strains isolated from vulvovaginal candidiasis

WU Yongqin, WANG Zhiheng, GAO Jing, CHEN Huifen, TANG Zhenhua, YING Chunmei.
（Department of Laboratory Medicine, Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China）

Objective To investigate the distribution and molecular epidemiology of Candida strains isolated from vulvovaginal candidiasis in Shanghai, and conduct molecular phylogenetic analysis of the strains. Methods Candida pathogens were collected from the patients with vulvovaginal candidiasis during the period from August 2015 to February 2016 in Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai First Maternity and Infant Hospital, and International Peace Maternity and Child Health Hospital. All the strains were identified and statistically analyzed. ATB FUNGUS 3 kit was used to determine the minimum inhibitory concentration of antifungal agents against these strains in vitro. Molecular typing was conducted using multilocus sequence typing (MLST) method. Phylogenetic analysis was carried out by eBURST and MEGA 6 software. Results Of the 2 185 strains of Candida, 1 988 were identif i ed as Candida albicans, 149 Candida glabrata, 20 Candida tropicalis and 28 other Candida species. Overall, 6.5% of the Candida albicans strains were resistant to fl uconazole. Twenty-six diploid sequence types (DSTs) were identified among the 93 strains of Candida albicans analyzed, including 50 fluconazole-susceptible strains with sporadic genotypes, but 43 fl uconazole-resistant strains clustered as one clonal complex (CC 69) on the same branch (MLST Clade 1) of phylogenetic tree. Conclusions Candida albicans was the main pathogen of vulvovaginal candidiasis in the three obstetrics & gynecology hospitals in Shanghai, which showed slightly higher resistance to fluconazole. It is necessary to monitor the spread of fl uconazole-resistant Candida albicans in these hospitals, especially clonal dissemination of CC 69 clone.

vulvovaginal candidiasis; Candida albicans; multilocus sequence typing; clonal dissemination

R379.4

：A

：1009-7708 ( 2017 ) 03-0321-05

10.16718/j.1009-7708.2017.03.017

2016-10-14

2016-11-21

上海申康医院发展中心市级医院临床辅助科室能力建设项目（SHDC22014016）。

1. 复旦大学附属妇产科医院检验科，上海 200011；2. 上海市第一妇婴保健院检验科；3. 国际和平妇幼保健院检验科。

吴永琴（1991—），男，硕士研究生，主要从事临床微生物的分子流行和耐药机制研究。

应春妹，E-mail：ycmzh2012@163.com。