袁莉莉， 丁百兴， 沈 震， 吴 湜， 徐晓刚， 李光辉

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药性及分子流行病学研究

袁莉莉， 丁百兴*， 沈 震*， 吴 湜*， 徐晓刚*， 李光辉*

目的 了解耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（CRPA）对抗菌药物的耐药性及分子生物学特征。方法 收集2013年1－12月复旦大学附属华山医院住院患者临床分离的CRPA 104株，采用琼脂稀释法对菌株行药敏测定；脉冲场凝胶电泳（PFGE）行同源性分析。结果 104株CRPA对美罗培南、亚胺培南的耐药率分别为85.6%、98.1%，对阿米卡星、庆大霉素的耐药率分别为18.3%、40.4%，对头孢他啶和头孢吡肟的耐药率分别为26.9%和21.2%，对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为44.2%和50.0%，对哌拉西林-他唑巴坦、头孢哌酮-舒巴坦和替卡西林-克拉维酸的耐药率分别为19.2%、26.9%和52.9 %，对氨曲南耐药率为26.9%，对黏菌素耐药率最低，仅为5.8%。PFGE分析存在48个型别（3株未能分型），9个克隆。克隆A是主要流行株，占41.6%（42/101），科室主要集中在神经外科、老年科及综合病房，其次为克隆B，占5.9%（6/101）。结论 医院内存在耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的多个克隆，应采取有效的感染控制手段，加强抗菌药物临床应用管理，延缓细菌耐药性产生并阻止耐药菌进一步播散。

铜绿假单胞菌 ； 碳青霉烯类耐药 ； 耐药性 ； 同源性分析

铜绿假单胞菌广泛分布于自然界及健康人的皮肤、肠道和呼吸道等部位，为医院感染主要的条件致病菌之一。近年来，随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，该菌对此类药物的耐药率一直处于高位水平[1-2]，给临床抗感染治疗带来了巨大的挑战。了解复旦大学附属华山医院 2013 年 1－12 月耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（CRPA）耐药特点及分子流行病学情况，对指导临床合理用药，控制与降低该菌引起的医院感染非常重要。本研究采用琼脂稀释法检测 104 株 CRPA 对 15 种常用抗菌药物的耐药性 ；脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行同源性分析。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 收 集 2013 年我 院 住 院患者送 检 的CRPA 菌株 104 株。标本来自于痰液、尿液、引流液等。剔除同一患者的重复菌株。入选标准：纸片法抑菌圈直径亚胺培南≤15 mm 或美罗培南≤15 mm，两者只要其中一种符合上述范围。鉴定采用法国生物梅里埃公司 API20NE 鉴定条。

1.1.2 抗菌药物 除替卡西林为大连美仑生物技术有限公司制品外，其余测试抗菌药物均购自于中国药品生物制品检定所。

1.1.3 培 养 基 和 主 要 试 剂 培 养 基 购 自 于 英 国OXOID 公司 ；内切酶 Spe I、浓度为 20 mg/mL 的蛋白酶 K 购自 TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用琼脂倍比稀释法检测药物的最低抑菌浓度（MIC），操作及结果判读按照2013 版 CLSI标准。药敏试验质控菌株为铜绿假单胞菌 ATCC27853、大肠埃希菌 ATCC35218。

1.2.2 PFGE ① 细菌 DNA 原位纯化 ：将细菌与等体积1%低熔点琼脂糖混匀后注模，成型凝胶块经蛋白酶K溶液裂解、已灭菌的蒸馏水及TE液多次洗涤，置于 4 ℃过夜。② 限制性内切酶原位消化：将原位纯化的凝胶块切成一定大小薄片，加 入 120 μL 酶 切 体 系（ 内 切 酶 SpeI）37 ℃ 孵 育3 h。③ 加样 ：把消化好的胶块及标准菌株 H9812置于胶梳板上，把梳子放入胶槽中，用 0.5×TBE液配制 1% Golden agarose 浇制电泳胶，室温下凝固 30 min 左右。凝固后用融化的自身胶或低熔点胶 封 闭 加 样 孔。 ④ 电 泳 参 数 ：6 V/cm，19 h， 角度变换 120°，转换时间为 2.16～54.17 s。 ⑤ 染色及图像采集：电泳结束后，EB染色。采用凝胶成像系统（Bio．Rad）采集凝胶 DNA 指纹图像。判读标准与文献一致[3]。

1.2.3 数据分析 采用 WHONET5.4 进行统计及汇总。

2 结 果

2.1 CRPA 临床流行情况

2.1.1年龄分布 分离 104 株 CRPA 的患者年龄在19～99 岁，平均 58 岁，其中 50 岁以上的患者占65.4%（68/104），19～50 岁患者占 34.6%（36/104）。2.1.2 科室分布 临床科室分布依次为神经外科33株（31.7%），ICU 21株（20.2 %），老年科18株（17.3%），综合病房15株（14.4%），神经内科7株（6.7%），普外科6株（5.8%），皮肤科、感染科、呼吸科和耳鼻咽喉科各1株（各占1.0%）。

2.1.3 标本来源 104 株 CRPA 中分离自呼吸道标本 88 株（85.6%）、腹腔引 流 液 8 株（7.7%）、尿液 2 株（1.9%）、血液 2 株（1.9%）、组织 2 株（1.9%）、胆汁 1 株（1.0%）、分泌物 1 株（1.0%）。

2.2 药敏试验结果

104 株 CRPA 对美罗培南、亚胺培南的耐药率分别为 85.6%、98.1%，对阿米卡星、庆大霉素的耐药率分别为 18.3%、40.4%，对头孢他啶和头孢吡肟的耐药率分别为 26.9% 和 21.2%。对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为 44.2% 和 50.0%。对哌拉西林-他唑巴坦、头孢哌酮-舒巴坦和替卡西林 -克拉维酸的耐药率分别为 19.2%、26.9% 和52.9 %。对氨曲南耐药率为 26.9%。对黏菌素耐药率最低，仅为 5.8%。见表1。

2.3 PFGE PFGE

采用 PFGE 对 CRPA 进行同源性分析，并用Bionumerisc 软 件 对其 PFGE 图谱 进行聚类分析，结果显示 PFGE 图谱相似值为 16.8%～99.6%，共存在 48 个型别（3 株未能分型），9 个克隆。克隆A 为优势流行株，占 41.6%（42/101），主要集中在我院的神经外科、老年科及综合病房，见图1；次之为克隆 B，占 5.9%（6/101），见图2。克隆 C、克隆 I各 2 株，各占 2.0%（2/101）。

3 讨论

铜绿假单胞菌是需氧不发酵糖革兰阴性杆菌，是一种重要的条件致病菌。目前，世界各地陆续出现了该菌耐碳青霉烯类药物的报道[4-6]，耐药情况严峻已成临床最棘手的问题之一。本研究中 104株 CRPA 多分离自 50 岁以上的中老年患者，主要集中在神经外科及 ICU，这可能与中老年患者自身免疫力低下，且神经外科及 ICU 绝大部分患者病情严重、住院时间长、普遍应用广谱抗菌药物、各种侵袭性操作频繁使用及医护人员消毒不严格等因素有关。分离株多数来源于呼吸道，与文献报道的一致[7]。药敏试验结果显示，该菌对多黏菌素 B 敏感率最高，达 83.7%，但低于台湾的 93.9%[8]。 其 次 为 阿 米 卡 星， 敏 感 率 达 68.3%。阿米卡星对其有良好的抗菌作用可能是该类药物多数对氨基糖苷类钝化酶稳定，且在临床中的用量较其他类药物少的原因。从药敏结果可以看出：CRPA 对多种抗菌药物均产生了较强的耐药性，在治疗方面可选择药物有限，可根据药物敏感试验结果选用抗假单胞菌β内酰胺类+氨基糖苷类或喹诺酮类 + 黏菌素的联合治疗[9]。

表1 104 株 CRPA 菌株对常用抗菌药物的药敏结果Table 1 Susceptibility prof i le of 104 strains of carbapenem-resistant P. aeruginosa to the commonly used antimicrobial agents

图1 42 株 A 型 CRPA 的聚类分析图Figure 1 Clustering analysis of 42 carbapenem-resistant P. aeruginosa strains by pulsed-f i eld gel electrophoresis

图2 6 株 B 型 CRPA 的聚类分析图Figure 2 Clustering analysis of 6 carbapenem-resistant P. aeruginosa strains by pulsed-f i eld gel electrophoresis

细菌同源性分析的方法有很多，包括随机扩增多态性 DNA（RAPD）、扩增限制性片段长度多态性分析（AFLP）、重复序列 PCR 分析（REP-PCR、ERIC-PCR）、MLST、PFGE 等。PFGE 具 有 良 好的分辨率、特异性、稳定性和结果可靠性，被誉为细菌分子分型技术的“金标准”，已被众多国家采用。有研究证实 PFGE 比 MLST 对铜绿假单胞菌的分辨率更高[10]，本研究通过 PFGE 对 CRPA 的DNA 分子条带类型进行分析，并使用 Bionumerisc软件对 PFGE 图谱进行聚类分析，发现这批菌株共分为 48 个型别（3 株未能分型），9 个克隆，分别为 克 隆 A～I。PFGE 图谱 相 似 值 16.8%～99.6%。A 型为主要型别有 42 株，占 41.6%，图谱相似值80.1%～98.0%。 在 3 月 4－7 日， 在 神 经 外 科 和综合病房都发现了相同分型的菌株感染，这一时间、地点和人群的高度集中性提示我院在3月初这段时间出现过小规模的交叉感染。其中，hsh243和 hsh264 都来自 3 月份神经外科的痰液标本 ；而hsh262 和 hsh265 都来自综合病房的痰液标本。在11－12 月，出现了在神经外科、综合病房和老年病房的多个聚类高峰，提示在这一段时间内也可能出现了小规模的交叉感染。

在 A 型 中 hsh1268 和 hsh1340 菌 株、hsh1117和 hsh854 菌株具有完全相同 PFGE 指纹。hsh1268是从1例神经外科女性患者的痰液中分离，而hsh1340 来自综合病房，同样为痰液样本，这提示可能存在同一克隆株的播散，但是并未发现除此之外来自神经外科患者也有与此完全相同的 PFGE分型。hsh1117 和 hsh854 分离自同一时期的老年病房中相同性别菌株相同来源的患者，从暴露史上分析，这2例患者均有吸痰史，提示2例患者很有可能感染同一菌株，具体原因是暴露于相同环境，还是患者之间接触传染尚不能确定。

其次为 B 型，6 株，占 5.94%，图谱相似值为80.3%～97.4%。hsh1033 和 hsh1319 菌 株 都 来 自神经外科年龄相似患者的痰液标本，由于住院时间不同，因此并不知道患者之间是否存在交叉感染的可能；也有可能是都暴露于相同环境所导致的相同菌株感染。hsh1208 和 hsh720 菌株具有完全相同 PFGE 指纹，但来自不同时期的不同病房，尚不能确定相互之间的关系。值得注意的是，这些完全同源的菌株科室分布集中，而且菌株与菌株之间检出时间跨度不大，皆在3个月以内，特别是 C 型的 hsh470 和 hsh547 都来自同一个月 ICU的痰液标本，提示可能来源同一菌株，也暴露了ICU 在感染的传播和扩散控制上存在一定问题。D型 hsh954 和 hsh976 也是来自同一个月的标本，但是菌株来源的患者和科室并不同，其传播途径值得进一步深入调查，但可以反映出不同的科室在这个时间段的消毒灭菌工作存在缺陷。

综上所述，对于 CRPA 的感染，应根据药敏结果合理应用抗菌药物，对于病房的管理应加强医护人员的手卫生和严格遵守无菌技术规范操作，加强留置医疗器械的护理，避免交叉感染。

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Antibiotic resistance and molecular epidemiology of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa

YUAN Lili, DING Baixing, SHEN Zhen, WU Shi, XU Xiaogang, LI Guanghui.
（Infection Control Unit, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China）

Objective To investigate the antibiotic resistance pattern and molecular epidemiology of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. Methods The antimicrobial susceptibility was measured by agar dilution method for the 104 strains of carbapenem-resistant P. aeruginosa (CRPA) collected from Huashan Hospital. The homology between these strains was evaluated by pulsed fi eld gel electrophoresis (PFGE). Results Of the104 CRPA strains, 85.6% were resistant to meropenem and 98.1% to imipenem. These strains also showed various percentages of resistance to amikacin (18.3%), gentamicin (40.4%), ceftazidime (26.9%), cefepime (21.2%), ciprof l oxacin (44.2%), levof l oxacin (50.0%), piperacillin-tazobactam (19.2%), cefoperazone-sulbactam (26.9%), ticarcillin-clavulanic acid (52.9%), aztreonam (26.9%), and colistin (5.8%). PFGE analysis showed that these strains were divided into 48 types, belonging to 9 clones. Only 3 strains were non-typeable. Clone A was the primary epidemic strain (41.6%, 42/101), which was mainly isolated from Neurosurgery, Geriatrics and General Ward. Clone B accounted for 5.9% (6/101) of the strains. Conclusions Multiple clones of carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa were prevalent in Huashan hospital. Effective infection control approaches should be adopted to prevent the development and the further spreading of antimicrobial resistance.

Pseudomonas aeruginosa; carbapenem-resistant; antimicrobial resistance; homology analysis

R378.991

：A

：1009-7708 ( 2017 ) 03-0289-04

10.16718/j.1009-7708.2017.03.012

2016-08-04

2016-11-24

复旦大学 附 属 华山医 院 医 院感染管 理 科 ，上海200040；*抗生素研究所。

袁莉莉（1984—），女，硕士，住院医师，主要从事医院感染防控工作。

李光辉，E-mail：liguanghui@fudan.edu.cn。