王禹锟 孙越 董文杰 吴婷

成釉细胞瘤患者的EPO/EPOR-JAK2-STAT5信号传导通路研究

王禹锟 孙越 董文杰 吴婷

目的探讨促红细胞生成素(EPO)/促红细胞生成素受体(EPOR)-激活的蛋白酪氨酸激酶-2(JAK2)-信号转导子和转录激活子5(STAT5)信号通路在成釉细胞瘤(AB)中的表达及意义,就AB的发病机制进行深入探索。方法采用免疫组化法对34例AB、8例牙源性角化囊肿(OKC)及7例牙胚(TG)三组标本中上述四种蛋白的表达进行检测。结果EPOR多分布于AB、OKC及TG的上皮成分的胞膜上与胞浆中；TG与AB比较差异无统计学意义(P＞0.05)；OKC表达与另两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。丛状型AB表达明显高于滤泡型AB,差异有统计学意义(P＜0.05)。无细胞变异型AB的表达明显高于颗粒细胞型AB,差异有统计学意义(P＜0.05)。而丛状型AB当中,许多肿瘤细胞表达强烈。EPO于上皮细胞成分相应胞浆当中较多分布,在AB与TG中具有较为相似的表达水平,而对于在OKC中的表达而言,其相比于TG,要明显弱于后者,差异有统计学意义(P＜0.05)。许多AB表达于中央星网状细胞、立方细胞或外周柱状细胞。诸多滤泡型AB的立方细胞或外周柱状细胞,在颜色方面,均略强于中央多边形细胞。AB、OKC与TG组间JAK2在细胞核及细胞浆中的表达比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；JAK2在颗粒细胞亚型、棘皮瘤亚型及细胞变异亚型表达比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论EPO/EPOR-JAK2-STAT5信号传导通路在AB、OKC及TG之间,以及AB的各亚型及各分型间均具有显著的表达。EPO/EPOR在AB中、瘤样病变及牙源性组织当中,利用JAK2-STAT5信号途径实现其作用的充分发挥,另外,EPO/EPOR-JAK2-STAT5通路相应异常活化与AB的发生与发展有关。

成釉细胞瘤；促红细胞生成素；促红细胞生成素受体；激活的蛋白酪氨酸激酶；信号转导子和转录激活子

AB乃是来源于上皮且具有最高发病率的牙源性肿瘤,当前以对此存有诸多病理分型,尽管均为良性肿瘤,但具有一些恶性肿瘤的相应生物学行为,存在恶变潜能、侵袭性生长及高复发率等特点,所以有学者将其划定为临界瘤［1-5］。近些年来,有关AB当中蛋白与基因异常的表达日益报道增多［6-13］,但在研究AB发生与发展方面的型号传导通路却比较少。本次研究通过运用免疫组化方法,将OKC与TG作为对照组,将AB及其亚型、分型作为实验组,就AB、TG和OKC当中EPO/EPOR-JAK2-STAT5信号传导通路的意义与表达,因此就其在OKC与AB的发生、发展,以及其在TG发育中所发挥出的作用予以明确。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2007年6月～2016年6月在本院口腔颌面外科行手术切除治疗的34例AB标本为AB组、8例OKC标本为OKC组、7例TG标本为TG组。TG 组来自7例下颌阻的第三磨牙时所收集的处于发育状态的牙胚,男4例,女3例,中位年龄13岁；OKC组8例标本分别来自上颌骨与下颌骨,各4例,男3例,女5例,中位年龄35岁；34例AB标本来自下颌28例,上颌6例,男19例,女15例,中位年龄32岁。依据组织学模式将AB组标本分类,即亚型包括：23例非细胞变异型、7例棘皮瘤型、4例颗粒细胞型；丛状型15例,滤泡型19例。

1.2 实验方法 试剂：SC-836：兔抗人STAT5多克隆抗体STAT5、SC-695：兔抗人EPOR多克隆抗体、SC-1310：山羊抗人EPO多克隆抗体EPO,均选自Santa Cruz公司。免疫组化S-P染色购买自广州博士德有限公司。全部标本均采用中性福尔马林(10%)浸泡固定,时间为24 h,运用酒精将其逐级脱水,运用二甲苯将其透明,用石蜡将其包埋,持续切片(3 μm),分别实施免疫组化染色与组织学染色。运用免疫组织化学S-P法,各项操作流程均需依据试剂盒说明书来完成,运用已知阳性片实施阳性对照,选用PBS取代第一抗体实施阴性对照,其他流程均相同。

1.3 结果判定 本次研究采用Leica DM 2500显微镜,Motic6.0采集系统［14］。由病理专家审阅免疫组织化学片与H.E片子。本次试验所获取的蛋白,若在胞核、胞膜及胞浆中呈现为棕黄色颗粒状,则将其定为阳性着色。牙源性肿瘤与牙源性组织相应免疫组化结果所持有的评价标准：依据免疫组化染色强度及阳性细胞百分数,将其划分为三组,即＞65%细胞染色强度,则反映此样本所持有的免疫组化反应性：(-)阴性,细胞不存在着色状况；(+)表示弱阳性至中度阳性,颜色从浅黄色至棕黄色；(++)表示强阳性,颜色为棕褐色［15］。

1.4 统计学方法 采用Rversion 2.4.1统计学软件进行统计分析。采用Kruskal-Wallis test及Mann-Whitney U-test对组间差异进行检测。P＜0.05表示存有统计学差异。

2 结果

EPOR多分布于AB、OKC及TG的上皮成分的胞膜上与胞浆中；TG与AB比较差异无统计学意义(P＞0.05)；OKC表达与另两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。部分TG上皮能够发现处于增殖活跃状态的上皮岛,而对TG上皮岛及上皮均存在有十分强的阳性表达。丛状型 AB表达明显高于滤泡型AB,差异有统计学意义(P＜0.05)。无细胞变异型AB的表达相比于颗粒细胞型AB,前者明显高于后者,差异有统计学意义(P＜0.05)。而丛状型AB当中,许多肿瘤细胞表达强烈。对于一些滤泡型AB,其呈现出一种相应芽样生长状态,阳性表达强烈。针对AB当中带有牙龈黏膜的组织切片,通过对牙龈黏膜下方进行观察,可发现其间质当中的serres上皮仍然存在有强阳性表达。EPO于上皮细胞成分相应胞浆当中较多分布,在AB与TG中具有较为相似的表达水平,而对于在OKC中的表达而言,其相比于TG,要明显弱于后者,差异有统计学意义(P＜0.05)。许多AB表达于中央星网状细胞、立方细胞或外周柱状细胞。诸多滤泡型AB的立方细胞或外周柱状细胞,在颜色方面,均略强于中央多边形细胞。针对丛状型AB而言,不管是中央细胞还是外周细胞,其多数情况均具有较强的表达。AB、OKC与TG组间JAK2在细胞核及细胞浆中的表达比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；JAK2在颗粒细胞亚型、棘皮瘤亚型及细胞变异亚型表达比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1,表2。

表1 牙胚、牙源性角化囊肿和成釉细胞瘤中EPO和EPOR的免疫组化表达(n)

表2 牙胚、牙源性角化囊肿和成釉细胞瘤中STAT5在胞浆和胞核中的免疫组化表达(n)

3 讨论

EPO要想发挥出其作用,首先需将EPOR激活,然后将下游的信号传导通路激活,由此方能实现。JAK2是EPOR直接而又单独性的下游信号分子。老鼠实验可知,如若缺乏JAK2,会因红细胞生成出现障碍,而幼鼠死于子宫中,也就是缺乏JAK2的细胞,没有应答上游 EPO。而对于STAT5而言,其乃是JAK2所持有的下游底物,关系到红系祖细胞能够长久生存。另外,如若小鼠STAT5a缺乏,还会导致泌乳能力逐渐丧失的状况,此结论一致于STAT5 是一种乳腺因子。当STAT5b缺乏时,则两性分化能力则会由此而丧失。由此可知,JAK-STAT 信号通路对胚胎发育具有良好的作用。又有研究可知,相比于处于正常状态的口腔黏膜当中的微弱表达,处于发育状态的STAT5与JAK2,其牙胚当中的表达更强。由此可知,针对JAK-STAT信号通路,可利用旁分泌及自分泌方式,积极参与到人类牙胚的发育过程中。另外,在胞浆中的表达,JAK2要明显强于胞核,而在胞核当中,STAT5的表达也要强于胞浆,由此知晓两者的定位位置。通过本次研究可知,EPOR多分布于AB、OKC及TG的上皮成分的胞膜上与胞浆中；TG与AB比较差异无统计学意义(P＞0.05)；OKC表达与另两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。部分TG上皮能够发现处于增殖活跃状态的上皮岛,而对TG上皮岛及上皮均存在有十分强的阳性表达。丛状型 AB表达明显高于滤泡型AB,差异有统计学意义(P＜0.05)。无细胞变异型AB的表达相比于颗粒细胞型AB,前者明显高于后者,差异有统计学意义(P＜0.05)。而丛状型AB当中,许多肿瘤细胞表达强烈。对于一些滤泡型AB,其呈现出一种相应芽样生长状态,阳性表达强烈。针对AB当中带有牙龈黏膜的组织切片,通过对牙龈黏膜下方进行观察,可发现其间质当中的serres上皮仍然存在有强阳性表达。EPO于上皮细胞成分相应胞浆当中较多分布,在AB与TG中具有较为相似的表达水平,而对于在OKC中的表达而言,其相比于TG,要明显弱于后者,差异有统计学意义(P＜0.05)。许多AB表达于中央星网状细胞、立方细胞或外周柱状细胞。诸多滤泡型AB的立方细胞或外周柱状细胞,在颜色方面,均略强于中央多边形细胞。针对丛状型AB而言,不管是中央细胞还是外周细胞,其多数情况均具有较强的表达。AB、OKC与TG组间JAK2在细胞核及细胞浆中的表达比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；JAK2在颗粒细胞亚型、棘皮瘤亚型及细胞变异亚型表达比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。由此可知,上述因子程度差异性与牙源性肿瘤及牙源性组织的发生发展有关；EPO/EPORJAK2-STAT5a信号通路不仅对于头颈部鳞状细胞癌相应侵袭性当中存在作用,而且在头颈部组织及牙源性肿瘤当中,同样发挥着作用,由此表明,此通路可能在头颈部肿瘤当中广泛存在；基于形态学角度来讲,观察到了口腔黏膜、serras上皮剩余及残余牙胚上皮等,乃是造成AB组织发生与发展的重要诱因。

综上所述,EPO/EPOR-JAK2-STAT5信号传导通路在AB、OKC及TG之间,以及AB的各亚型及各分型间,均具有显著的表达。EPO/EPOR在AB中、瘤样病变及牙源性组织当中,利用JAK2-STAT5信号途径实现其作用的充分发挥,另外,EPO/EPOR-JAK2-STAT5通路相应异常活化与AB的发生与发展有关。

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Research of signal transduction pathway of EPO/EPOR-JAK2-STAT5 in ameloblastoma patients

WANG Yu-kun,SUN Yue,DONG Wen-jie,et al.Department of Stomatology,Second Affiliated Hospital of Mudanjiang Medical University,Mudanjiang 157000,China

ObjectiveTo investigate expression and significance by signal transduction pathway of erythropoietin(EPO)/erythropoietin receptor(EPOR)-activated protein tyrosine kinase-2(JAK2)-signal transducers and activators of transcription 5(STAT5) in ameloblastoma(AB),and to make further exploration of pathogenesis in AB.MethodsImmunohistochemistry method was applied to detect expression of the four protein in 34 AB samples,8 odontogenic keratocyst(OKC) samples and 7 tooth germ(TG) samples.ResultsEPOR generally distributed in epithelial cytomembrane and cytoplasm in AB,OKC and TG,and there was no statistically significant difference between TG and AB(P＞0.05),while OKC had statistically significant difference comparing with the other two groups(P＜0.05).Expression of plexiform type AB was obviously higher than follicular type AB,and their difference had statistical significance(P＜0.05).Expression of non-cytometaplasia AB was much higher than granular cell type AB,and the difference had statistical significance(P＜0.05).Tumor cells showed strong expression in plexiform type AB.Distribution of EPO was mainly in epithelial cell cytoplasm,and its expression was similar in AB and TG,while its expression in OKC was obviously lower than TG.The difference had statistical significance(P＜0.05).Main expression of AB occurred in central stellate reticulum,cuboidal cell and peripheral columnar cell.Cuboidal cell and peripheral columnar cell in follicular type AB had darker color than central stellate reticulum.The difference of expression of JAK2 in cell nucleus and cytoplasm across AB,OKC and TG had statistical significance(P＜0.05).The difference of expression of JAK2 had statistical significance acrossgranular cell subtype,acanthoma subtype and cytometaplasia subtype(P＜0.05).ConclusionSignal transduction pathway of EPO/EPOR-JAK2-STAT5 shows remarkable expression in AB,OKC,TG and subtypes of AB.EPO/ EPOR shows its effect fully by signal pathway of JAK2-STAT5 in AB,tumor-like lesion and odontogenic tissues.Abnormal activated EPO/EPOR-JAK2-STAT5 pathway is correlated with occurrence and development of AB.

Ameloblastoma; Erythropoietin; Erythropoietin receptor; Activated protein tyrosine kinase; Signal transducers and activators of transcription

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.01.016

2016-12-09］

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(项目编号：12541851)

157000 牡丹江医学院附属二院口腔科(王禹锟董文杰 吴婷)；哈尔滨市第四医院口腔科(孙越)

吴婷