李 钧 童 哲 魏 勇 舒正华 王西迅

(嘉兴市武警医院骨三科，浙江 嘉兴 314000)

miR-125b靶向Smad4调控非创伤性股骨头坏死骨髓基质干细胞成骨分化与增殖的相关性

李 钧 童 哲 魏 勇 舒正华 王西迅

(嘉兴市武警医院骨三科，浙江 嘉兴 314000)

目的 探讨miR-125靶向Smad4调控对非创伤性股骨头坏死骨髓基质干细胞成骨分化与增殖的影响。方法 培养人骨髓基质干细胞系HMSC-bm，将miR-125b 模拟物(mimics)、miR-125b 抑制物(inhibitor)和对照(miR-NC)转染到细胞内，qRT-PCR和Western印迹检测过表达对Smad4表达的影响，构建野生型和突变型的Smad4的3′-UTR荧光素酶报告载体，分别命名为Wt-Smad4和Mut-Smad4，将构建好的质粒做三组共转染，即Wt-Smad4与miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及 miR-NC与miR-125b mimics，检测荧光素酶的活性；BMP-2诱导HMSC-bm分化，将miR-125b mimics和si-Smad4转染到分化的细胞内，以不转染的细胞作为参照，检测miR-125b靶向Smad4对细胞分化的影响；将miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC转染到对数生长期的HMSC-bm细胞系，胆囊收缩素(CCK)8检测过表达对细胞增殖的影响；将miR-125b mimics与pcDNA3.1-Smad4质粒共转染；miR-125b mimics；miR-NC组；miR-NC与pcDNA3.1-Smad4组转染到HMSC-bm细胞系，检测miR-125b靶向Smad4对细胞增殖和分化的影响。结果 转染 miR-125b mimics组Smad4的相对表达量显著低于miR-125b NC组，转染miR-125b inhibitor组Smad4的相对表达量显著高于miR-125b NC组(P<0.01)，Western印迹的检测结果与其一致，荧光素酶结果显示，Wt-Smad4与miR-125b mimics组荧光素酶活性显著低于miR-NC与miR-125b mimics组(P<0.01)，结果证实Smad4是miR-125b的靶基因；miR-125b mimics和si-Smad4 组Runx2和Osterix mRNA表达量显著低于对照组(P<0.01)；CCK8检测结果显示，miR-125b mimics组在24 h、48 h、72 h 3个时间点细胞的增殖率显著高于对照组(P<0.01)，miR-125b inhibitor 组在3个时间点的细胞增殖率显著低于对照组(P<0.01)；miR-125b靶向Smad4对细胞增殖分化的影响试验结果显示，miR-125b mimics组细胞增殖显著高于miR-NC组(P<0.01)，miR-125b mimics与pcDNA3.1-Smad4质粒共转染组细胞增殖显著高于miR-NC(P<0.05)，miR-NC与pcDNA3.1-Smad4组细胞增殖显著低于miR-NC组(P<0.05)，miR-125b mimics组和miR-125b mimics+pcDNA3.1-Smad4组细胞中Runx2和Osterix的mRNA相对表达量显著高于miR-NC组(P<0.01)；miR-NC+pcDNA3.1-Smad4组细胞中Runx2和Osterix的mRNA相对表达量显著低于miR-NC组(P<0.01)。结论 Smad4是miR-125b的靶基因，上调miR-125b促进细胞增殖，下调miR-125b减弱细胞增殖，miR-125b靶向Smad4调控HMSC-bm细胞增殖和分化。

miR-125b；Smad4；骨髓基质干细胞；分化；增殖

非创伤性股骨头坏死一般采用姑息治疗。一般患者在4～5年将出现股骨头的塌陷，需要进行全髋关节置换〔1〕。间充质干细胞(MSCs)是一种成体干细胞，具有多项的分化潜能，可分化成软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等〔2〕。研究显示，激素诱导的MSCs向脂肪细胞分化，能使股骨头的坏死加重，当发生股骨头坏死后，股骨头、茎、干MSCs增殖和分化能力下降，导致机体进行自身的修复能力下降〔3〕。MiRNAs是一类含有19～25个核苷酸的小分子非编码RNA，能与靶基因结合从而抑制靶mRNA的翻译和使靶mRNA降解，达到转录后调控的目的〔4〕。研究显示，miR-125b可参与MSCs成骨的分化，下调miR-125b后，可促进MSCs成骨的分化〔5〕。本研究通过预测miR-125b的靶基因，证实miR-125b靶向调控Smad4对骨髓MSCs分化和增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 DMEM培养基购自美国Gibco，胰蛋白酶均购自美国Sigma；BMP-2购自美国RD公司；SYBR Green购自上海生工生物工程有限公司；双荧光报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；miR-125b mimics、miR-125b inhibitor、miR-NC购自广州锐博生物科技有限公司；多功能酶标仪购自美国Thermo公司；实时定量PCR仪购自美国ABI公司；倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司；细胞培养箱购自美国西盟公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人MSCs(HMSCs)的分离和培养 从非创伤性股骨头坏死患者取骨髓2 ml，DMEM培养液等倍稀释，500 r/min离心10 min，吸掉上清和上层脂肪，再次等倍稀释后，加入Ficoll淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心30 min，收集单个核细胞，洗涤2次，加入含有10 ml的DMEM细胞培养液中，37℃，5%CO2培养箱中培养。3 d后换液，弃去未贴壁细胞，待贴壁细胞长满瓶底后，用0.25%Trypsin-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化传代。

1.2.2 细胞转染 取对数生长期的HMSC-bm细胞系，加入0.25 %的胰蛋白酶消化细胞，细胞呈单个存在时，转移到一个新的离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入不含有胎牛血清(FBS)的不完全培养液接种到细胞培养板中，在37℃，5% CO2培养箱中培养。当细胞融合度达到60%时，将miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC与不完全培养基混合后加入到HMSC-bm细胞，滴加到24孔板表面，37℃，5% CO2培养箱中培养48 h。qRT-PCR及Western印迹检测Smad4基因表达。

1.2.3 荧光素酶报告基因检测 通过PicTa、TargetScan、The miRBase三大靶基因预测库预测miR-125b与Smad4的3′-UTR有结合位点。将含有miR-125b结合位点的Smad4的3′-UTR片段插入PGL-REPORT载体报告基因中，构建野生型和突变型的Smad4的3′-UTR荧光素酶报告载体，分别命名为Wt-Smad4和Mut-Smad4。将构建好的质粒做三组共转染，即Wt-Smad4与miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及 miR-NC与miR-125b mimics。37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养24 h后收集细胞，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测双荧光素酶活性。

1.2.4 miR-125b对HMSC-bm细胞系分化的影响 取第三代HMSC-bm细胞系，观察到细胞达到80%融合时，将培养瓶中的细胞用0.25%胰酶消化，接种到3个12孔板中，加入含有10%FBS 的DMEM培养液，37℃，5% CO2培养箱中培养。当3个12孔板中的细胞融合度达到60%时，在15个孔中加入10%FBS 的DMEM+100 ng/ml BMP-2 配制成成骨诱导液作为实验组，15个孔加入含有10%FBS 的DMEM培养液为阴性对照组。3 d换液1次，细胞生长达到60%～70%时，将miR-NC、miR-125b mimics、si-Smad4、 miR-125b mimics与pcDNA3.1-Smad4质粒共转染，miR-NC与pcDNA3.1-Smad4组细胞加入含有5 μl脂质体和500 μl无血清培养基中，充分混匀后，室温静置40 min，FBS洗涤细胞后，加入1.5 ml不含有抗生素的无血清培养基。转入6孔板中，37℃，5% CO2培养箱中培养4～6 h，换成完全培养基用于后续的试验。

1.2.5 miR-125b对HMSC-bm细胞系增殖的影响 取转染后生长至对数期的miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC三组细胞，用细胞培养液悬浮细胞，调整细胞浓度为每毫升中含有3×105个细胞，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液100 μl，37℃，5% CO2培养箱中培养24、48、72 h后，加入10 μl胆囊收缩素(CCK)8溶液，37℃，5% CO2培养箱孵育2 h，酶标仪在波长为450 nm处测定并记录各组的吸光度OD。

1.2.6 miR-125b靶向Smad4对细胞增殖的影响 实验分为四组：一组为miR-125b mimics与pcDNA3.1-Smad4质粒共转染；一组为miR-125b mimics；一组为miR-NC；一组miR-NC与pcDNA3.1-Smad4。取对数生长期的HMSC-bm细胞系，胰酶消化细胞，转移到一个新的离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，与不含有FBS的不完全培养液接种到细胞培养板中，在37℃，5% CO2培养箱中培养24、48、72 h，当细胞融合度达到60%时，将四组细胞与培养基混合，充分混匀后，37℃，5% CO2培养箱中培养。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 靶基因预测 转染 miR-125b mimics组Smad4 mRNA的相对表达量(0.36±0.09)显著低于miR-125b NC组(0.98±0.11)，转染miR-125b inhibitor组(3.45±0.23)显著高于miR-125b NC组(P<0.01)，Western印迹的检测结果与其一致。其中miR-125bNC组Smad4蛋白表达量为0.657±0.100，miR-125bmimics组为0.221±0.050,miR-125b inhibitor组为1.181±0.090。为了更准确地证实Smad4是miR-125b的靶基因，接下来进行双荧光素酶检测，通过三组共转染，即Wt-Smad4与miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及 miR-NC与miR-125b mimics。结果发现，Wt-Smad4与miR-125b mimics组荧光素酶活性(0.45±0.06)显著低于miR-NC(1.00±0.11)与miR-125b mimics组(0.95±0.09，P<0.01)，Mut-Smad4和miR-125b mimics与miR-NC和miR-125b mimics之间差异不显著(P>0.05)。这些结果证实Smad4是miR-125b的靶基因。见图1。

图1 Western印迹检测转染后Smad4的蛋白表达量

2.2 miR-125b对HMSC-bm细胞分化的影响 将miR-125b mimics和si-Smad4转染到HMSC-bm细胞，诱导剂诱导分化后7 d收集样品。qRT-PCR检测Runx2和Osterix mRNA表达量，miR-125b mimics、si-Smad4 Runx2 mRNA表达量(0.38±0.06，0.50±0.07)和Osterix mRNA表达量(0.49±0.05，0.60±0.06)显著低于对照组(1.00±0.04,1.00±0.05,P<0.01)，说明 miR-125b能靶向调节Smad4调控HMSC-bm细胞分化。

2.3 miR-125b对细胞增殖的影响 转染后24、48、72 h，miR-125b mimics组在3个时间点细胞的增殖率显著高于对照组(P<0.01)，miR-125b inhibitor 组显著低于对照组(P<0.01)，说明miR-125b能对细胞的增殖有调控作用。见图2。

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01图2 miR-125b对细胞增殖的影响

2.4 共转染对细胞增殖的影响 将miR-125b mimics与pcDNA3.1-Smad4质粒共转染；miR-125b mimics；miR-NC组；miR-NC与pcDNA3.1-Smad4组转染到细胞后72 h，收集细胞，CCK8检测细胞增殖，图3显示，miR-125b mimics组细胞增殖显著高于miR-NC组(P<0.01)，miR-125b mimics与pcDNA3.1-Smad4质粒共转染组细胞增殖显著高于miR-NC(P<0.05)，miR-NC与pcDNA3.1-Smad4组细胞增殖显著低于miR-NC组(P<0.05)。说明过表达Smad4减弱了miR-125b对细胞的增殖。

与miR-NC比较：1)P<0.05，2)P<0.01图3 转染后不同时间点各组细胞增殖率

2.5 共转染对细胞分化的影响 将miR-125b mimics与pcDNA3.1-Smad4质粒共转染；miR-125b mimics；miR-NC组；miR-NC与pcDNA3.1-Smad4组转染到细胞，诱导剂诱导分化后7 d收集样品。qRT-PCR检测细胞中Runx2和Osterix mRNA表达量，结果显示，miR-125b mimics组(3.92±0.18，3.81±0.23)和miR-125b mimics+pcDNA3.1-Smad4组(2.23±0.14，2.01±0.12)细胞中Runx2和Osterix的mRNA相对表达量显著高于miR-NC组(0.99±0.02,0.98±0.03,P<0.01)；miR-NC+pcDNA3.1-Smad4组细胞中Runx2和Osterix的mRNA相对表达量(0.40±0.07,0.45±0.08)显著低于miR-NC组(P<0.01)。

3 讨 论

目前没有一种学说能很好地解释非创伤性股骨头坏死的病因和发病机制〔6〕。研究者发现，非创伤性股骨头坏死的MSCs数量降低，增殖能力降低，成骨能力减弱，然而成脂能力增强；非创伤性股骨头坏死与MSCs有关〔7〕。miRNA是一种进化保守、数量多的小分子RNA，在转录后调控中起到重要的作用〔8〕。研究发现，miRNA在干细胞的分化、增殖等过程中发挥作用，对调控MSCs成骨成脂分化过程也有重要作用，miR-125b能抑制MSCs的成骨分化〔9〕。然而，miR-125b是何种机制调控MSCs的增殖分化还需要进一步探索。

Runx2是成骨细胞成骨和分化过程中重要的控制基因，可促进成骨细胞标志物的表达，当Runx2基因缺失，会引起骨发育不良或者发育终止〔10〕。Osterix是在Runx2之后发现的成骨细胞分化关键的转录因子，研究发现，缺乏Osterix的小鼠，软骨内成骨和膜内成骨缺乏，成骨细胞分化的各种标志物的表达也将下降〔11〕。这说明这两个基因对骨髓干细胞的分化起了重要的作用。本研究说明 miR-125b能靶向调节Smad4调控HMSC-bm细胞分化。另外，本研究说明转染 miR-125b能对细胞的增殖有调控作用。这也提示在创伤性股骨头坏死患者治疗时，可以通过转染高低表达的miRNA的表达来实现。miR-125b对骨髓干细胞增殖有影响，而且本研究说明过表达Smad4抑制减弱了miR-125b对细胞的增殖。

综上，Smad4是miR-125b的靶基因，上调miR-125b促进细胞增殖，下调miR-125b减弱细胞增殖，miR-125b靶向Smad4影响HMSC-bm的增殖和分化。

1 吴 微.辨 “形” 论治下非创伤性股骨头坏死不同形态修复带与塌陷的相关性研究〔D〕.广州：广州中医药大学，2015.

2 Zhang J，Guan J，Niu X，etal.Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis〔J〕.J Transl Med，2015；13(1)：49.

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〔2016-10-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

童 哲(1981-)，男，主治医师，主要从事创伤、显微研究。

李 钧(1969-)，男，副主任医师，硕士，主要从事创伤、显微研究。

R681.8

A

1005-9202(2017)02-0306-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.020