崔云峰,金 月,魏 来,金明光

(1.北京劲松口腔医院,北京100020;2.长春工业大学医院 口腔科;3.长春市中医院 口腔科;4.吉林大学口腔医院)

近年来，抗血管生成治疗已成为治疗肿瘤的新策略，尤其是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)与肿瘤的发生，发展，浸润，转移的关系备受关注，VEGF水平表达升高与多种肿瘤不良预后密切相关[1]，因此抑制VEGF基因表达，可阻止肿瘤细胞的生长，研究显示，VEGF在舌癌组织中呈高表达状态[2]。故本研究应用siRNA沉默VEGF基因表达。旨在为人口腔舌癌基因治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料人舌癌细胞株(Tca8113细胞)由北京大学口腔医院馈赠，实验所用试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。MTT(噻唑蓝)试剂购美国sigma公司。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(日本Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1siRNA的制备参照[3]进行操作，略加改进。

所有siRNA都通过T7RNA聚合酶体外转录法进行，具体操作参照promega T7 Ribo-MAX Express RNAi syste 试剂盒方案。

1.2.2细胞培养及siRNA转录参照[4]进行。

2 结果

2.1 siRNA转染24 h后Tca8113细胞增殖变化转染24 h后各组Tca8113细胞有明显的改变，与空载体对照组相比，无论在细胞形态学方面还是细胞增殖数量均明显不同见图1、2。

图1 脂质体对照组细胞(100×) 图2 siRNA转染组细胞(100×)

2.2 Westeen Blot结果

转染正义链siRNA1的Tca8113细胞蛋白表达明显被抑制，与错义链siRNA2脂质体容载量siRNA3及对照组相比有明显差异，见图3，表明siRNA可有效特异的抑制VEGF蛋白表达、证明其转染的siRNA是成功的。同时抑制了Tca8113细胞的增殖。

1.siRNA1 2.siRNA2 3.siRNA3 4.正常对照组

2.3 MTT结果

结果显示siRNA 正义组与脂质体组及正常对照组之间相比差异显著，P<0.01，而脂质体组，错义组与正常对照组相比无显著差异，P>0.05.证明重组的siRNA降低Teag8113细胞代谢，能够特异的抑制Tca8113细胞的增殖。见表1。

2.4 流式细胞术结果

在共转染Tea8113细胞培养24 h后，进行流式细胞仪分析，结果显示，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少， G2/M期细胞相对增多，且细胞凋亡率升高与脂质体空载组及正常对照组相比差异非常显著。见表2。

表1 siRNA正义组与其他各组对Teag8113细胞增殖抑制率

表2 转染siRNA24 h后细胞周期进程及凋亡率

2.5 VEGF含量表达

siRNA转染Teag8113细胞上清液中VEGF含量检测明显低于各对照组，差异有统计学意义。见表3。

表3 各组Teag8113细胞培养上清中VEGF含量表达

3 讨论

siRNA干扰是近年来发展起来的特异性调控基因表达的分子生物学技术，小分子RNA按照碱基互补配对原则，与靶基因特异性结合并使其降解、沉默、从而抑制基因的表达。本研究利用siRNA干扰技术，共转染VEGF siRNA小片段分子，可特异有效的下调Tca8113细胞的VEGF基因沉默。从而抑制Tca8113细胞的增殖[5]。研究结果显示，共转染siRNA24 h后，Tca8113细胞增殖数量明显减少。与对照组及空载组、错义组相比差异有显著意义。细胞增殖变缓，数量减少。Western Blot结果亦印证Tca113细胞RNA蛋白量减少，细胞增殖发生了特异性抑制现象。MTT结果表明共转染的siRNA正义组与siRNA错义组、脂质体空载组、正常对照组之间差异非常明显，P<0.01，证明siRNA能够降低Tca8113细胞的代谢。此外，本研究应用流式细胞术法检测共转染的siRNA Tca8113细胞周期与细胞凋亡率的改变，结果显示，共转染的细胞与对照组细胞相比，其细胞周期有明显的S期，G2/M期阻滞，G0/G1期细胞增多与对照组相比差异有统计学意义。细胞不能进入S期，造成G2/M期细胞相对增多，而G2/M期细胞增多是细胞凋亡的普遍反应。细胞周期与细胞凋亡看似相互独立的生殖过程，实际上是统一在整个细胞的网络中，并通过一系列调控机制协调两者之间的关系[6]。即可阻滞细胞周期进程，还可引起细胞凋亡。

VEGF不仅是新生血管形成的前提条件，同时也是促进肿瘤生长和转移的重要因素，因此抗血管生成已成为目前肿瘤治疗的重要方向。尤其在晚期肿瘤治疗中VEGF及VEGFR抑制剂已经陆续取得成功。期待未来能够开展更多的临床研究。

本研究通过共转染技术，从基因水平上观察其对肿瘤细胞凋亡和细胞周期的影响。为肿瘤的基因治疗提供了一条新的思路。