马群飞

GB 4789.35－2016《乳酸菌检验》解读

马群飞

对GB 4789．35－2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验乳酸菌检验》的范围、术语和定义、设备和材料、培养基和试剂、检验程序、操作步骤、结果与报告、乳酸菌的鉴定、培养基及试剂等章节逐条进行分析解读。讨论了标准变化的依据以及存在的问题，对食品微生物实验室正确实施使用该标准提出了技术性建议。

国家标准；食品安全；乳酸菌；检验

2017年1月9日，国家卫生和计划生育委员会网站公布了一系列新的食品安全国家标准，其中GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》（以下简称2016版标准）实施日期为2017年6月23日[1]。2010年6月1日开始实施的GB 4789.35-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》[2]，因为在方法原理、操作步骤等方面比以往版本变化很大，加上标准宣贯没有及时跟进，检验机构困惑较多，实际工作中也出现了较多偏差，影响了标准的实施效果。在2016版标准的前言中，对于修改了定义、检验程序、培养基和试剂等章节也没有明确描述。为了帮助微生物检验人员更好地理解2016版标准的变化，对2016版标准进行解读。

1 范围

2016版标准规定“本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。” 2014年8月6日国家卫生和计划生育委员会公布的《可用于食品的菌种名单》中，还有乳球菌属和片球菌属。现在许多乳品生产企业在发酵乳产品中添加了这些球菌。因此，采用2016版标准进行发酵乳制品的乳酸菌检验时，无法避免这两类球菌造成的干扰。

2 术语和定义

2016版标准前言没有说明修改了乳酸菌的定义。在这个部分的修订，仅仅是将原来的链球菌属修改为嗜热链球菌属。但是，这是一个典型的技术性错误，嗜热链球菌（Streptococcus Thermophilus）仅仅是链球菌属中的一个种。这个部分最大的问题，在于定义的乳酸菌仅限于三个属，与国家卫生和计划生育委员会公布的《可用于食品的菌种名单》中覆盖的菌种不符，必将对生产企业和微生物实验室的实际工作造成更多的困扰。

3 设备和材料

2016版标准将天平的感量由0.1 g修改为0.01 g，主要是为了保证对于那些活菌菌种制品的称量准确性。但是遗漏了“厌氧装置、恒温水浴、漩涡混合仪、显微镜、微生物抽滤装置”等设备，尤其是厌氧装置是至关重要的设备。恒温水浴主要为了准确控制倾注琼脂的温度或用于解冻冰冻样品。

4 培养基和试剂

除了将莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基修改为莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）和半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）改良MRS培养基外，前言部分没有说明这个章节还有其他变化。2016版标准增加了生理盐水作为稀释液。而微生物学实验室常用的磷酸盐稀释液，有可能减少乳酸菌复苏数量[3]，日常工作应避免使用。这个部分遗漏的培养基和试剂，包括棉籽糖发酵管、菊糖发酵管、马尿酸生化管等。而“4.13莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯”和新增的“4.14 半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）：纯度＞99%”这两种试剂仅仅在附录A的培养基及试剂章节出现，所以应该放在附录部分直接规定即可。

5 检验程序

虽然前言部分没有专门说明，但是2016版标准中，图1乳酸菌检验程序图有较多的修改。主要变化是修改了样品稀释液的接种方法和接种量、修改了培养基而且规定培养基添加量为15 ml、培养时间一律从48 h修改为72 h。另外一个明显的修改，就是将菌种鉴定明确为“可选做”。

6 操作步骤

6.1 样品制备

6.1.1和6.1.2分别对于无菌操作和冷冻样品的解冻方式进行规定。但是无菌操作这样的基本常识，应该是在GB 4789.1《食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则》中规定[4]。这个章节的技术问题，主要是对于无菌稀释液和均质方式没有详细规定，导致有些实验室忽视稀释液的含氧量并使用旋转刀片均质器处理样品，既容易将链球菌、乳杆菌、双歧杆菌常常形成的长链切断，造成菌数检验结果偏高，也可能因为这样的均质方式增加了稀释液里面的氧含量，降低了厌氧菌的生存能力。所以，这个部分应明确使用拍击式均质器及均质袋，并且按照GB 4789.28-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》中的规定[5]，预先煮沸并迅速冷却来降低无菌稀释液中的氧含量，再用于样品的稀释。对于液体样品，明确规定采用充分振摇的方式进行样品稀释，与使用均质器均质的效果差别很大，所以，执行2016版标准时应注意。

6.2 步骤

梯度稀释时，使用规格18 mm×180 mm（2.6）这样较为粗大的无菌试管，有利于样品稀释液的混匀，否则在小试管里面很难充分混匀。标准中没有描述到的实验室常用仪器，还有漩涡混合仪。主要是反复吹打方式混匀样品稀释液，容易增加稀释液含氧量和微生物污染机会，用漩涡混合仪可以保证样品稀释液的均匀，减少污染。

2016版标准中这个部分技术性变化最多。乳酸菌计数部分，增加了一个表，分别描述了培养条件及结果说明。总体来说，现在标准的做法，就是乳酸菌总数采用加法计算代替了原来的减法计算。其他的变化，除了改用莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）和半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）改良MRS培养基外，还将原来每皿0.1 ml接种量表面涂布修改为每皿1 ml倾注琼脂、明确规定平皿中培养基的使用量约15 ml、培养的时间由48 h延长至72 h。这些修改，主要依据ISO 8261、ISO 7889等ISO标准和这一次进行标准整合的SN/T 1941.1-2007《进出口食品中乳酸菌检验方法 第1部分：分离与计数方法》中的做法[6-8]。全球公认添加半胱氨酸盐酸盐，可以提高双歧杆菌的耐受性。目前美国公共卫生协会的乳酸菌检验方法还采用表面涂布0.1 ml[3]，虽然有利于菌落观察和挑取，但是倾注法的乳酸菌复苏更好。此处的技术性问题，是培养基使用量应为20 ml以上，才能符合GB 4789.28-2013《食品安全国家标准 食品微生物检验 培养基和试剂的质量要求》对于培养时间超过48 h的培养基应倾注4 mm左右的厚度和20 ml以上量的强制性规定[5]。另外，关于嗜热链球菌的操作，建议实验室在“将冷却至48 ℃的MC培养基倾注入平皿约15 ml，转动平皿使混合均匀”时，应明确“将冷却至48℃的MC培养基趁热摇匀，使碳酸钙沉淀充分悬浮后倾注入平皿不少于20 ml，立即转动平皿使混合均匀，放置水平面等待凝固”。只有这样操作，才可以保证最后观察到乳酸菌菌落在不透明平板上形成的碳酸钙透明溶解圈。同时，对于嗜热链球菌一般观察的应该是“深”红色小菌落，以区别乳杆菌属偶尔形成的菌落干扰。另外，规定“从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成”，实际是从样品稀释到“将平板放在厌氧环境内倒置”应在15 min内完成，否则厌氧菌还是很容易死亡。有条件的实验室，可以在厌氧工作站中进行这些步骤，可以获得更准确的检验结果。

因为这个部分的三种培养方法都是要求“培养后计数平板上的所有菌落数”，所以，这个条款的主要难点在于如何根据菌落形态分别计数乳酸菌和干扰菌，避免标准定义之外的其他微生物形成菌落造成干扰，因为各种微生物单从菌落外观进行区别判定难度太大，需要实验室制定作业指导书来规定。

6.3 菌落计数

这个部分基本没有修改。与GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》基本一致[9]，实验室不容易理解错误。

6.4 结果的表述

2010版本的这个部分，描述为“计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克或每毫升中菌落总数结果。”因为加样量为0.1 ml，所以单单直接乘以相应的稀释倍数，明显比实际值低了10倍。2016版标准将加样量修改为1 ml后，这个计算问题也随之迎刃而解了。

6.5 菌落数的报告

这个部分没有修改。

7 结果与报告

这个部分没有修改。

8 乳酸菌的鉴定（可选做）

这个部分基本没有修改。2016版标准中还是没有加入其他食品微生物检验方法系列标准已经广泛应用的全自动生化鉴定系统和生化鉴定试剂盒，需要靠手工生化实验来鉴定。这个条款的主要问题是没有覆盖目前批准用于食品生产的乳酸菌菌种，以及如何区分乳球菌、片球菌。表2中“棉子糖”与GB 4789.34-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》表1描述的“棉籽糖”名词不一致[10]。

9 附录A 培养基及试剂

2016版标准中，增加了生理盐水配方。但是A.1.1 成分中遗漏了蒸馏水1 000 ml，而且灭菌时间与其他GB 4789系列标准中生理盐水的灭菌时间均为15 min不同。A.3.3规定的“用带有0.22 mm微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中”，属于重复描述，因为在A.3.1和A.3.2已经确定了两种溶液都是过滤除菌的。关于MC培养基的制法，因为该培养基有平皿倾注和表面接种两种使用方式，故应在A.4.2“分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min”之后，加上“使用时，融化琼脂，冷却至48 ℃左右，趁热充分摇匀琼脂，立即倾注平皿，置水平面待琼脂凝固”。这样才可以保证其中的碳酸钙均匀分布在培养基中，发挥中和细菌产酸并形成可辨识的透明溶解圈的作用。A.5 乳酸杆菌糖发酵管这个名称有点儿问题。2016版标准中没有乳酸杆菌这个定义，按照正文中，应该是乳酸菌发酵管，因为可用于乳杆菌和嗜热链球菌的生化实验。另外，使用121 ℃高压灭菌15 min～20 min这个做法也值得商榷，多数的糖类都不耐高压，容易导致假阳性。缺少马尿酸生化管的配方和制法，因为这个物质不属于糖类。其余部分没有技术性修改，仅仅是将原来列在成分条款的pH放在制法条款描述了。

[1] GB 4789．35-2016． 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验[S]． 2016．

[2] GB 4789．35-2010． 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验[S]． 2010．

[3] 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心译． 乳品检验标准方法[M]． 北京：中国标准出版社，2008：257-259．

[4] GB 4789．1-2016． 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则[S]．2016．

[5] GB 4789．28-2013． 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求[S]． 2013．

[6] ISO 8261：2001． Milk and milk products-General guidance for the preparation of test samples，initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination[S]． 2001．

[7] ISO 7889：2003． Yogurt-Enumeration of characteristic microorganisms — Colony-count technique at 37℃[S]． 2003．

[8] SN/T 1941．1-2007． 进出口食品中乳酸菌检验方法 第1部分：分离与计数方法[S]． 2007．

[9] GB 4789．2-2016． 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定[S]． 2016．

[10] GB 4789．34-2016． 食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验[S]． 2016．

Interpretation for GB 4789.35-2016 Examination of Lactic Acid Bacteria

MA Qunfei Laboratory of Hygienic Microbiology, Fujian Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou Fujian 350001, China

GB 4789.35-2016 National Food Safety Standard- Food Microbiological Examination: Lactic Acid Bacteria was analyzed and interpreted. By analyzing the scope, terms and definitions, equipment and materials, media and reagents, inspection procedures, operating procedures, results and reports, identification of lactic acid bacteria, medium and reagents, the basis of the standard change and the existing problems were discussed, and the technical suggestions for the correct application of the standard in food microbiology laboratory were put forward.

national standard; food safety; lactic acid bacteria; examination

R155

A

1674-9316（2017）16-0001-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．16．001

福建省疾病预防控制中心卫生微生物检验科，福建 福州350001