张安龙， 董婷婷， 王雪青， 王 晔

(陕西科技大学 轻工科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

一株产氢菌的分离鉴定与产氢特性

张安龙， 董婷婷， 王雪青， 王 晔

(陕西科技大学 轻工科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

从造纸厂厌氧颗粒污泥中分离出一株高效的产氢细菌DW01，通过16S rDNA序列分析，表明DW01菌株属于Raoultella属，与Raoultellasp.NGB-FR77相似性为100%.同时，在温度为30 ℃的条件下，进一步优化了DW01菌株在不同碳源、氮源、pH的培养条件下发酵产氢性能，结果表明，该菌株在以葡萄糖为碳源，L-谷氨酸为氮源，初始pH为6.0的条件下，获得最佳氢气产量和最佳产氢速率，分别为188.9±2.1 mL/g和93.3±7.5 mL/L/h.DW01菌株作为良好的发酵产氢菌，可进一步优化产氢条件，提高产氢量.

生物制氢； 厌氧污泥； 分离鉴定； 产氢优化

0 引言

在化石石油资源日益枯竭、环境污染日趋严峻的今天,氢气的开发与利用备受世人的关注，生物暗发酵处理生物质废弃物制沼气已逐渐成为生物质能源领域的研究热点之一，传统活性污泥发酵过程中耗氢菌较多，生物质氢转化率较低.因此，获得高效产氢菌种，是实现生物制氢工业化的核心技术问题.目前，产氢菌株方法有直接筛选菌株和通过基因工程等技术手段改良目标菌株，但后置操作复杂、设备昂贵、成功率低，尽管国际上已开展了大量相关研究, 但生物制氢产业化的报道相对较少[1-5]，因此分离高效产氢菌，为工业化制氢技术提供种质资源，是实现工业化制氢的重要方面.

目前已知的暗发酵产氢微生物主要分布于Enterobacter，Citrobacter，Bacillus及Clostridium属[6]，但大多数菌株耐酸性较弱，如支晓鹏等[7]分离出的Enterobactersp. Z-16和Clostridiumsp.C-32分别在最佳初始pH为7.0和8.0的情况下，比产氢量为2.35和2.45 mol H2/mol葡萄糖，Junghare M等[8]分离出ClostridiumbutyricumTM-9A在最佳初始pH为8.0，比产氢量为3.1 mol H2/mol葡萄糖，对上述所述的三株发酵产氢菌，当初始pH降低为6.0时，产氢量分别降低了94%、58%和60%，说明该类菌株对酸性的耐受性较弱，当发酵产氢过程中产生的副产物有机酸使体系pH持续降低时，会抑制微生物产氢，导致生物质转化效率较低.基于上述问题，本文从厌氧颗粒污泥中分离和筛选出一株高性能耐酸性发酵产氢菌，通过16S rDNA测序手段实现产氢菌种属鉴定，并对分离出的产氢菌进行了发酵性能研究.

1 实验部分

1.1 样品来源

用于分离菌株的厌氧颗粒污泥来自福建某造纸厂的厌氧处理反应器.

1.2 培养基

(1)液体培养基(试剂均为分析纯)：葡萄糖10 g/L,L-谷氨酸0.883 g/L,10% NaCl 10 mL,营养母液 (次氮基三乙酸10.0 g,MgSO4·7H2O 29.5 g,CaCl2·2H2O 3.335 g,FeSO4·7H2O 0.099 g,(NH4)6Mo7O24·4H2O,0.009 3 g，微量元素(蒸馏水100 mL,ZnSO4·7H2O 1.095 g,EDTA(acid) 250 mg,FeSO4·7H2O 500 mg,H3BO311.4 mg,MnSO4·H2O 154 mg,CuSO4·5H2O 39.2 mg,Co(NO3)2·6H2O 24.8 mg)50 mL/L,蒸馏水1 000 mL,pH7.0)20mL/L，磷酸盐缓冲溶液 (1 000 mL双蒸水,KH2PO468.05 g,K2HPO487.09 g,pH7.0) 20 mL/L,维生素溶液烟酸0.1 mg/mL,烟酸硫胺0.05 mg/mL,生物素1 ug/mL)10 ml/L.

(2)固体培养基：液体培养基+琼脂(1.6%～2.0%).

1.3 实验方法

1.3.1 产氢菌的分离和鉴定

(1)富集：取10 g的厌氧颗粒污泥，置于装有200 mL的无菌蒸馏水中，加入数粒玻璃沸石，用氮气将发酵罐中的空气洗脱干净，后置于恒温振荡器中振荡5 h，将颗粒污泥打碎，使其均匀分散在水中.用无菌注射器吸取5 mL，接种至盛有25 mL培养液的发酵罐中.在30±1 ℃的恒温震荡器中培养48 h.

(2)初选：取1 mL富集好的菌液用无菌超纯水依次制成10-1～10-5稀释梯度的菌悬浮液，分别用纯木质接种棒对梯度悬浮液进行平板划线，置于厌氧培养箱中，在30 ℃的条件下进行培养，10 h后获得单菌落，挑取单菌落于平板培养基中重复划线三次，在光学显微镜下观察菌体形态大小是否一致，重复划线直至得到纯种菌株.

(3)复选：将分离得到的产氢菌株进行发酵实验，分别接种至盛有50 mL发酵液的注射器中，至于30 ℃、100 r/min的条件下，进行发酵产气实验，用气相色谱法检测产气中是否含有H2，选择产气能力较强的菌株为实验菌株并对其进行冷冻保存及鉴定.

1.3.2 菌株的产氢特性

将分离出的高效产气菌株接种到装有50 mL培养基的厌氧发酵罐中,置于(30±1) ℃、转速100 r/min生化培养箱中活化一次，将活化的菌种接种于1 000 mL的发酵罐中进行扩大培养，当菌株生长至对数期时，在无菌环境下将其摇匀分装置50 mL的离心管中，离心(5 000 r/min,10 min)收集菌体，用不同条件的培养基悬浮，调节OD值均为0.4，后将悬浮液接种至50 mL发酵罐中进行厌氧发酵.测试DW01菌株在不同碳源、不同的氮源、不同的起始pH值时对发酵产氢的影响.其中，碳源包括单糖(鼠李糖、木糖、半乳糖)和二糖(D-纤维素二糖、乳糖、蔗糖、D-麦芽糖)、氮源为L-谷氨酸、酵母粉、蛋白胨、NaNO3、NH4Cl；用1 mol/L的盐酸溶液调节初始pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；每组做三个平行实验，结果取平均值.定时测其氢气产量、pH值、菌浊，通过修正的Gompertz方程考察了该菌株的产氢特性.

1.3.3 发酵终端气相产物的检测

生物气检测气相色谱仪(岛津GC-2014)检测[9]，担体TDS-01(60/80目)，载气为氮气，流速70 mL/min，进样量500 uL，柱室温度70 ℃，气化室温度80 ℃，检测器100 ℃.

1.3.4 细菌的产氢动力学模型

根据细菌生长与时间之间的关系[10]，对Gompertz方程进行修正后得到修正的Gompertz方程，如式(1)所示：

(1)

式(1)中：H—细菌发酵所产生的氢气体积(mL/L)；Hmax—细菌可能产生的最大氢气体积(mL/L)；Rm—细菌的最大产氢速率(g/L/h)；λ—细菌产氢的延滞时间(h)；t—反应时间(h)；e—为自然对数，数值为2.718 28.

1.3.5 16S rDNA的序列分析

细菌DNA的提取参照文献[11,12].用于16S rDNA扩增的PCR反应引物为通用引物Forward 27 F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；Reverse1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-

TT-3′.PCR反应体系(50 uL)：5 ng/uLDNA模板2uL,10×buffer2.0μL,2.5 mmol/L(Mg2+)1.5 uL；dNTPs 5μL；20 pmol/L引物各1μL；ExTaq DNA酶0.25μL；加双蒸水至50 uL；PCR扩增条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1.5 min，重复以上3个步骤，进行30个循环；延伸72 ℃ 5 min；扩增结束后；取2.5 uL扩增产物，加入溴酚蓝作指示剂，利用涡流搅拌器混匀，短暂离心，检测PCR扩增产物，用EB作为染色剂涂布染色30 min，在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳，观察电泳结果.切胶回收目的片段基因，进行DNA测序.测序工作委托宝生物工程(大连)有限公司完成.

2 结果与讨论

2.1 DW01菌株的生长发育树分析

将筛选出的DW01菌株进行16S rDNA 基因序列测定分析，所得序列与GenBank数据库中已知16S rDNA 序列进行比较，通过NCBI的Blast序列比对进行同源性分析.结果如图1所示，DW01菌株的基因与Raoultella的关系密切，Blast序列对比结果发现其与Raoultellasp. NGB -FR77相似性达到100%，从DW01菌株的生长发育树可以看出DW01菌株与Raoultella处于同一分支，表明DW01菌属于Raoultella属的一株新的菌株.

图1 基于16S rDNA序列的 菌株的系统发育树

2.2 DW01菌株对不同碳源的利用

碳源对发酵产氢是一个重要的参数,在生物制氢细菌的活动和产氢量中起关键作用.本文对此菌株利用不同碳源情况进行了考察，旨在研究其在处理造纸废液过程中对碳源的利用情况.

表1列出了在温度30 ℃、pH为7.0条件下，DW01菌株对不同碳源的利用的动力参数，从表1中可以看出，在以L-谷氨酸为氮源，碳源浓度为10 g/L的情况下，DW01菌株不能利用L-鼠李糖产生氢气，但可以利用单糖(木糖、半乳糖、葡萄糖)和二糖(D-纤维素二糖、乳糖、蔗糖、D-麦芽糖)发酵产氢，其中，葡萄糖的累积产氢量最大，为161.3 mL/g,蔗糖次之，为117.4 mL/g,DW01菌株利用蔗糖发酵产氢的累积产氢量优于文献[13]报道的Clostridiumpapyrosolvens菌株.该菌株对乳糖也表现出了较好的发酵产氢性能，为109.8 mL/L.DW01菌株利用不同碳源发酵产氢的迟滞时间相差较大，其中利用葡萄糖发酵产氢迟滞时间最短，为10.8 h左右，而其他碳源的迟滞时间都在30～40 h之间.比产氢率最高的为蔗糖，1.63 mol H2/mol底物，最低的为木糖，0.08 mol H2/mol底物.从发酵

终端的pH及生长情况看，在以L-鼠李糖为碳源时，发酵终端pH值相较其他各组最低，为4.96，OD600为0.527，而以蔗糖、葡萄糖为碳源的情况下，发酵终端的pH分别为5.30、5.84和OD600分别为0.93、1.021，相较其他各组不同碳源发酵产氢情况，说明DW01菌株在以L-鼠李糖为碳源的情况下，可以完成自身的生长，但不能发酵产氢.总体来看，DW01菌株对半纤维素水解液中存在量相对比较多的单糖(半乳糖、葡萄糖)及二糖(D-纤维素二糖)具有较好的发酵产氢性能.

2.3 不同氮源对DW01菌株发酵产氢性能的影响

氮是细胞的一种重要组成元素，细胞所吸收的氮素营养用于合成细胞内各种氨基酸和碱基，从而合成菌体的蛋白质、核酸等细胞成分，其中无机氮源是微生物生长的速效氮源，而有机氮源能够为微生物生长提供氮元素及必须的生长因子，在以10g/L的葡萄糖为碳源，考察了不同氮源对DW01菌株发酵产氢性能的影响，如图2所示.

表1 DW01菌株对不同碳源的利用

图2 DW01菌株在不同氮源条件下 的产氢过程拟合曲线

根据表2列出的DW01菌株在不同氮源条件下Gompertz模型拟合产氢菌的生长过程所获得的动力学参数，结合图2可以看出，该菌株可以利用多种氮源进行发酵产氢，当使用有机氮源L-谷氨酸时累积产氢量最大，为161.4 mL/g，酵母浸粉次之，为122.6 mL/g；蛋白胨与NH4Cl相比较前两种氮源，该菌株的累积产生氢气量较少，分别为92.5 mL/g和87.3 mL/g，该菌株在以NaNO3为氮源的情况下不能生长和发酵产氢.总体而言，有机氮源更有利于DW01菌株发酵产氢，这可能是由于有机氮源在微生物生长代谢过程中提供了必要的氨基酸及生长因子.但在实际工业生产中，考虑到经济成本问题，对于DW01菌株可以使用无机氮源NH4Cl代替部分有机氮源，从而减少有机氮源的使用量，具有良好的工业开发潜力.

表2 Gompertz 模型拟合产氢菌的

2.4 不同初始pH对发酵产氢性能的影响

在温度为30 ℃条件下，以10 g/L的葡萄糖为碳源，L-谷氨酸为氮源,考察了DW01菌株在不同pH条件下的发酵产氢能力，实验结果如图3所示.

根据表3列出的DW01菌株在不同pH条件下Gompertz模型拟合产氢菌的生长过程所获得的动力学参数,结合图3可以发现，DW01菌株在pH从5.0到9.0变化的过程中，过高或过低都会对产氢性能产生影响.当pH为6.0时，累积产氢量最大，为189.5 mL/g，产氢速率最快为93.3 mL/L/h.当pH为9.0时，该菌株的累积产氢量相较其它各组低，产氢速率及迟滞时间最长，分别为66.3 mL/g、28.4 mL/L/h和35.5 h，这可能是由于在不同pH条件下，产氢酶的活性受到抑制或是细胞代谢途径受到影响[14].

表3 Gompertz模型拟合产氢菌的

图3 DW01菌株在不同初始pH 条件下的产氢过程拟合曲线

3 结论

从厌氧颗粒污泥中分离出23株厌氧发酵产氢菌，对其中一株产氢性能较好的DW01菌株进行了16S rDNA序列对比分析及产氢性能研究，结果表明，DW01菌株属于Raoultella属的一个新种，与Raoultellasp. NGB-FR77相似性达到100%.在温度为30 ℃条件下，发现该菌株具有较宽的pH适应范围，能在较低初始pH5.0的环境中生长且具有较强的产氢性能.当DW01菌株在初始pH为6.0、L-谷氨酸为有机氮源发酵葡萄糖时获得最大产氢量188.9±2.1 mL/g，最大产氢速率为93.3±7.5 mL/L/h.同时，DW01菌株也可以利用多种氮源、以不同碳源为底物发酵产氢.

[1] 张存胜,王文娟,王振斌,等.产氢菌的分离鉴定及发酵性能[J].化工进展,2016,35(4):1 184-1 189.

[2] 刘合钦,徐 莉,周翔南,等.产氢菌的分离鉴定及其产氢特性研究[J].生物技术通报,2009(10):194-197.

[3] 樊进茹,王世英,李 佳,等.产氢菌AUH-BG208的分离鉴定与产氢特性[J].河北农业大学学报,2010,33(2):66-69.

[4] 伍 琪,邓超冰,才金玲,等.糖厂污泥中高效产氢菌的分离鉴定及产氢优化[J].环境科学与技术,2012,35(8):163-169.

[5] David B L,Lawrence P,Murray Le.Biohydrogen production:Prospects and limitations to practical application[J].International Journal of Hydrogen Energy,2004,29(2):173-185.

[6] 马诗淳,罗 辉,尹小波,等.厌氧产氢微生物研究进展[J].微生物学通报,2009,36(8):1 244-1 252.

[7] 支晓鹏,刘清锋,邬小兵,等.产氢菌Enterobactersp.和Clostridiumsp.的分离鉴定及产氢特性[J].生物工程学报,2007,23(1):152-156.

[8] Junghare M,Subudhi S,Lal B.Improvement of hydrogen production under decreased partial pressure by newly isolated alkaline tolerant anaerobe,ClostridiumbutyricumTM-9A: Optimization of process parameters[J].International Journal of Hydrogen Energy,2012,37(4):3 160-3 168.

[9] 秦 智,任南琪,李建政,等.发酵生物制氢反应器的产氢菌生物强化作用研究[J].环境科学,2007,28(12):2 843-2 848.

[10] 许继飞.同步代谢秸秆木糖和葡萄糖的产氢新菌种及其产氢特性[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学,2010.

[11] 冯广达,陈美标,羊宋贞,等.用于PCR扩增的细菌DNA提取方法比较[J].华南农业大学学报,2013,34(3):439-442.

[12] 陈双雅,东秀珠.一个新的产氢细菌的鉴定及产氢特性的研究[J].微生物学报,2004,44(4):411-416.

[13] 吴薛明.Biolog鉴定产氢发酵细菌及其产氢能力的研究[J].应用化工,2006,35(7):491-493.

[14] 潘春梅,张晓静,樊耀亭,等.产氢菌ClostridiumbutyricumP22的分离鉴定及其产氢特性研究[J].环境科学与技术,2011,34(8):9-13,17.

【责任编辑：陈 佳】

Isolation and characterization of a hydrogen-production bacteria

ZHANG An-long， DONG Ting-ting， WANG Xue-qing， WANG Ye

(College of Bioresources Chemical and Materials Engineering， Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

An efficient hydrogen-producing bacteria named DW01 was isolated from the anaerobic paper mill granular sludge,and the 16S rDNA sequence analysis showed that DW01 strain belonged toRaoultellagenus,and was identified having high similarity of 100% withRaoultellasp. NGB-FR77.Meanwhile,under temperature of 30 ℃ conditions,effects of carbon sources,nitrogen source and initial pH on the hydrogen production with DW01 were also studied.Results showed that when the strain utilized glucose as the carbon source,L-glutamic acid as nitrogen source under initial pH6.0 condition, the maximum hydrogen yield and hydrogen production rates were obtained as 188.9±2.1 mL/g and 93.3±7.5 mL/L/h. For DW01 strain was regarded as a advantage hydrogen production bacteria,it should be further optimized to improve the hydrogen production performance.

bio-hydrogen； anaerobic sludge； isolation and identification； hydrogen producting characteristics

2016-10-17

国家十二五科技支撑计划项目(2011BAC11B04); 陕西科技大学研究生创新基金项目

张安龙(1963-)，男，陕西延安人，教授，研究方向：造纸工业废水生物处理

1000-5811(2017)01-0040-05

Q939

A