杜乐妍，王海烽，时 晓，赵宝华，何宏轩*

(1.河北师范大学，河北石家庄 050024；2.北京市水生野生动植物救护中心，北京 102100；3.中国科学院动物研究所，北京 100101)

眼镜蛇中间克吕沃菌的分离鉴定及药敏试验

杜乐妍1,3，王海烽3，时 晓2，赵宝华1*，何宏轩3*

(1.河北师范大学，河北石家庄 050024；2.北京市水生野生动植物救护中心，北京 102100；3.中国科学院动物研究所，北京 100101)

为了研究北京市昌平区蛇场眼镜蛇的死亡原因，对眼镜蛇进行剖检、病理组织观察、病原菌的分离培养、生化鉴定、16 S rRNA PCR以及致病力试验，确定致病菌为中间克吕沃菌。药敏试验结果显示，该菌对阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美洛培南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、左氧沙星高度敏感，对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明、氯霉素、四环素、哌拉西林耐药。试验结果可为眼镜蛇感染中间克吕沃菌的治疗提供依据。

眼镜蛇；中间克吕沃菌；分离鉴定；药敏试验

中间克吕沃菌为革兰阴性菌，属于肠杆菌科、克吕沃菌属[1]。1981年Farme等正式确立克吕沃菌属，包括抗坏血酸克吕沃菌(Kluyveraascorbata)、栖冷克吕沃菌(Kluyveracryocrescens)和克吕沃菌种群3(Kluyveraspp)[2]，中间克吕沃菌属于克吕沃菌属种群3[3]。19世纪80年代早期，克吕沃菌被认为是人体内的正常菌群之一，不具有致病性[2]。然而，近年来关于克吕沃菌感染的病例越来越多，包括胃肠道感染[4-5]、尿路感染[6-7]、软组织感染[8-9]等，甚至败血症[10]以及其他的严重感染[1，7]。目前，已报道的感染案例主要以人为主，未见蛇感染该菌的报道。2014年10月，北京市昌平区蛇场眼镜蛇出现腹泻、行动迟缓、停食、消瘦以及死亡情况。通过对患病眼镜蛇进行病原菌的分离鉴定以及致病力试验，确定导致眼镜蛇死亡的致病菌，进行体外药敏试验，从而指导蛇场用药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 5条患病眼镜蛇均来自北京市昌平区蛇场，其中1条已死亡；SD大鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要试剂 营养琼脂培养基、肉汤培养基，北京陆桥技术有限责任公司产品；2×TaqPCR Master Mix，天根生化科技有限公司产品；DNA标准DL 2 000，宝生物工程(大连)有限公司产品；BD革兰阴性/阳性细菌鉴定/药敏板，上海碧迪医疗器械有限公司产品；药敏纸片，北京天坛药物生物技术开发公司产品。

1.2 方法

1.2.1 患病眼镜蛇的剖检及病理组织观察 对患病眼镜蛇进行剖检，观察并记录其内脏器官的病理变化。用100 mL/L福尔马林对患病眼镜蛇心脏、肝脏、肾脏等组织固定，制作病理切片观察。

1.2.2 病原菌的分离培养与形态学观察 无菌条件下，取患病眼镜蛇的咽拭、肛拭、心脏、肝脏、肾脏、肺组织接种于营养琼脂平板，37℃恒温培养18 h。对优势菌的单菌落划线培养，进行纯化，观察其形态，并进行革兰染色。

1.2.3 病原菌的生化鉴定 将病原菌的纯培养菌液稀释至麦氏浓度0.5～0.6，使用BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定仪，对分离菌进行生理生化鉴定。

1.2.4 病原菌的16 S rRNA鉴定 以纯化后的单菌落为模版，进行细菌16 S rRNA扩增，引物序列：27F：5′ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR纯化产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，将测序结果在NCBI上进行比对。将得到的序列用MEGA6进行分析，构建进化树。

1.2.5 病原菌药敏试验 使用Kirby-Bauer法[11]，稀释菌液至麦氏浓度0.5，在MH平板均匀涂布，贴上19种药敏片，每块平板5片，37℃培养24 h，参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)药敏标准判断结果。

1.2.6 SD大鼠致病力试验 将病原菌培养16 h后，调整菌液浓度至1.5×109CFU/mL。取SD大鼠6只，随机分成2组，其中试验组5只，对照组1只，试验组采取腹腔注射的方法进行攻毒，攻毒剂量为0.2 mL/10 g体重，对照组采取相同的方法注射同等剂量的灭菌生理盐水[12-13]。试验组和对照组分开饲养，观察记录大鼠的发病情况。

2 结果

2.1 患病眼镜蛇的病理变化

对患病眼镜蛇进行剖检，发现其肺部和心脏肿大，肝脏、肺、肾脏均出现不同程度的出血(图1A、图1B)，其中肝脏病变最严重，同时，肠道、肺、肾脏、食管均有不同程度的出血或纤维素性渗出(图1C、图1D)。观察病理组织切片发现心肌增生，纤维蛋白渗出(图2A)，肺出血、水肿，肺泡壁增厚(图2B)，肝脏组织出现颗粒性坏死，淋巴细胞增加(图2C)。

A,D.肝脏；B,C.肺脏

A,D.Liver；B,C.Lung

图1 剖检病理变化

Fig.1 Pathological lesions in autopsy

A.心脏(600×)；B.肺脏(600×)；C.肝脏(600×)

A.Heart(600×); B.Lung(600×);C.Liver(600×)

图2 眼镜蛇病理组织切片图

Fig.2 Histopathological slice observation in cobra

2.2 病原菌的分离培养与形态学观察

分离得到1株优势菌株，在营养琼脂平板上为圆形、半透明、表面光滑的菌落。进行革兰染色，镜检结果为革兰阴性杆菌。

2.3 病原菌生化鉴定结果

使用BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定仪进行鉴定，可信度高于90%，给出结果(表1)。与BD鉴定仪细菌库标准菌株的生化鉴定结果相比，分离菌只有精氨酸-精氨酸-AMC、L-亮氨酸-AMC这两项结果不符。BD PhoenixTM-100细菌鉴定仪结果显示该菌为中间克吕沃菌的可信度为99%，可初步可将病原菌鉴定为中间克吕沃菌。

表1 病原菌的生化鉴定

Table 1 The biochemical identification of the pathogenic bacteria

项目Item分离菌Isolatedbacteria标准菌Standardbacteria精氨酸-精氨酸-AMCARARR-+苷氨酸-AMCGLYB-VL-精氨酸-AMCLARGH-VL-亮氨酸-AMCLLEUH-+L-脯氨酸-AMCLPROB--L-色氨酸-AMCLTRY--乙酸ACT-V柠檬酸盐CIT-VD-甘露醇DMNT+V丙二酸MLO-V顺芷酸TIG--GAMMA-L-谷氨酰-NALGGH--PNP-BD葡糖苷BDGLU++BETA-阿洛糖BALL-VDEDXTROSEDEX++D-半乳糖DGAL++D-蜜二糖DMLB++蔗糖DSUC-VL-阿拉伯糖LARA+V甲基-B-葡糖苷MBGU+VN-乙酰-氨基半乳糖NGA--鸟氨酸ORN+V七叶酸ESC++苷氨酸-脯氨酸-AMCGLPRB--戊二酰-苷氨酸-精氨酸-AMCGUGAH--L-谷氨酸-AMCLGTA-VL-苯丙氨酸-AMCLPHET--L-焦谷氨酸-AMCLPYR--赖氨酸-丙氨酸-AMCLYALD-V福寿草醇ADO--多黏菌素ECLST--ALPHA-酮戊二酸KGA-V多黏菌素BPXB--U-N-乙酰-BD-氨基葡糖NAG--赖氨酸-丙氨酸-AMCLYALD-VBIS(PNP)磷酸盐BPHO++BETA-龙胆二糖BGEN++D-果糖DFRU++D-葡糖酸DGUA++山梨醇DSBT--半乳糖醛酸GRA+VL-鼠李糖LRHA++麦芽酮糖MTU++N-乙酰-葡糖胺NGU++尿素URE--

注：“+”为阳性反应;“-”为阴性反应;“V”为可疑。

Note："+" Positive;"-" Negative; "V" Ariable.

2.4 病原菌的16 S rRNA鉴定结果

病原菌的16 S rRNA基因PCR扩增凝胶电泳显示该菌扩增的基因片段约为1 466 bp左右(图3)。将测序结果在NCBI中进行比对，发现其与GenBank登录的多株中间克吕沃菌(KM222638,KT767953,KT767943,KT767942,KT767802)同源性均为99%，说明该菌为中间克吕沃菌。使用MEGA 6制作16 S rRNA基因序列进化树(图4)，表明分离菌(Kluyveraintermedia cobra)与中间克吕沃菌亲缘关系最近，处于同一进化枝上。

M.DNA标准DL 2 000; 1.病原菌16 S rRNA PCR产物

M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR products of 16 S rRNA of bacteria

图3 病原菌16 S rRNA PCR扩增电泳图

Fig.3 Electrophoresis of PCR products of 16 S rRNA of bacteria

图4 16 S rRNA基因序列进化树

2.5 病原菌药敏试验结果

分离的病原菌对阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美洛培南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、左氧沙星高度敏感；对头孢唑林、环丙沙星中度敏感；对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明、氯霉素、四环素、哌拉西林耐药(表2)。

2.6 SD大鼠致病力试验

试验组大鼠接种菌液29 h后，表现为精神委靡，行动迟缓，食欲不振，呈腹式呼吸。接种36 h内，试验组大鼠全部死亡，对照组大鼠正常。对死亡大鼠进行剖检发现，其肠道水肿、出血(图5)。无菌条件下取死亡大鼠的肝脏、肺脏、脾脏、心脏和肠道接种于营养琼脂平板，分离得到病菌，用细菌16 S rRNA PCR鉴定为中间克吕沃菌。

3 讨论

随着国家对特种养殖业的扶持，眼镜蛇养殖业

得到迅速发展，在养殖过程中，疾病尤其是细菌性疾病是制约养殖业发展的重要因素之一。与其他人兽共患病的病原微生物相比，关于蛇类细菌性病原的研究较少，因此养殖场一旦暴发疾病，很容易造成蛇类大量死亡，给养殖户带来严重损失。韦平等[12]从患腐皮病的蛇中分离到变形杆菌、金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌等；王德青等[13]从患口腔炎的尖吻蝮中分离到金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌；梁月梅等[14]从蛇中分离到奇异变形杆菌；苏接瑜等[15]从眼镜蛇中分离到缓慢葡萄球菌等。

目前，关于克吕沃菌感染的病例较少，已报告的感染病例主要以人为主。本试验从患病眼镜蛇中分离出中间克吕沃菌，致病力试验表明，该菌是导致眼镜蛇死亡的致病菌，这是首次从眼镜蛇中分离出中间克吕沃菌，丰富了蛇类病原菌样本库。

蛇病的防治是蛇类养殖的重要环节，其关键在于检测与用药。药敏试验结果显示，克吕沃菌分离株对阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美洛培南等抗菌药物高度敏感，对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明、氯霉素、四环素、哌拉西林耐药。根据药敏试验结果，可选用阿米卡星、庆大霉素等药物进行治疗。同时，养殖户在用药时要注意不要长期使用同一种药物，以免产生耐药性。

表2 病原菌药敏试验结果

Table 2 Antimicrobial sensitivity of pathogenic bacteria

药敏片名称Antimicrobialname药物含量/μgDrugcontent结果Result阿米卡星 Amikacin30S庆大霉素 Gentamicin10S亚胺培南 Imipenem10S美洛培南 Meropenem10S头孢唑林 Cefazolin30I头孢他啶 Ceftazidime30S头孢噻肟 Cefotaxime30S头孢吡肟 Cefepime30S氨曲南 Aztreonam30S氨苄西林 Ampicillin10R阿莫西林/克拉维酸Amoxicillin/Clavulanate20/10S氨苄西林/舒巴坦Ampicillin/Sulbactam10/10R哌拉西林/他唑巴坦Piperacillin/Tazobactam100/10S复方新诺明Trimethoprim/Sulfamethoxazole1.25/23.75R氯霉素 Chloramphenicol30R环丙沙星 Ciprofloxacin5I左氧沙星 Levofloxacin5S四环素 Tetracycline30R哌拉西林 Piperacillin100R

注：R.耐药；I.中度敏感；S.高度敏感。

Note：R.Resistance;I.Intermediate;S.Sensitive.

图5 SD大鼠剖检病理变化

值得注意的是，在之前的报道中，克吕沃菌只感染人，本试验从眼镜蛇中分离出克吕沃菌，表明克吕

沃菌极可能是一种人畜共患病的致病菌。因此，加强眼镜蛇养殖过程中的疾病防治和管理，不仅有利于养殖业的发展，还具有重要的公共卫生意义。

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Isolation,Identification and Antimicrobial Susceptibility Test ofKluyveraintermediain Cobra

DU Le-yan1,3,WANG Hai-feng3,SHI Xiao2,ZHAO Bao-hua1,HE Hong-xuan3

(1.HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang,Hebei,050024,China;2.TheAquaticWildlifeRescueandConservationCenter,Beijing,102100,China;3.InstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,Beijing,100101,China)

This study focused on the bacterial pathogen that infected snakes.Kluyveraintermediawas isolated from sick cobra of snake farm in Changping district,Beijing,through postmortem,histopathological examination,pathogen isolation,biochemical identification,16 S rRNA PCR,and pathogenicity test.The result of antimicrobial susceptibility test showed thatKluyveraintermediawas highly sensitive to amikacin,gentamicin,gentamicin,meropenem,meropenem,cefotaxime,cefepime,cefepime,amoxicillin/clavulanate,piperacillin/tazobactam and levofloxacin; but resistant to ampicillin,ampicillin,chloramphenicol,trimethoprim/sulfamethoxazole,tetracycline and piperacillin,which provided useful information for treatment of cobra infection withKluyveraintermedia.

cobra;Kluyveraintermedia;isolation and identification;antimicrobical susceptibility test

2016-03-16

杜乐妍(1990-)，女，河北石家庄人，硕士研究生，主要从事分子细菌学研究。*通讯作者

S858.9

A

1007-5038(2016)12-0073-05