郝景锋，李静姬，张宇航，尹柏双，付连军，黄 岩，李心慰，李小兵，赵晨旭，刘国文*

(1．吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林 132101；2.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062)

吉林省奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及药敏试验

郝景锋1，李静姬1，张宇航1，尹柏双1，付连军1，黄 岩1，李心慰2，李小兵2，赵晨旭2，刘国文2*

(1．吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林 132101；2.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062)

为了解吉林省各地区奶牛乳房炎发病情况，以便于科学合理防治该病，对长春市、吉林市、白城市以及延吉等多个大型奶牛场200份乳样进行了细菌分离与鉴定，并对其主要致病菌进行敏感药物筛选试验。结果显示，导致吉林省奶牛乳房炎发生的主要病原菌为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌以及停乳链球菌等，在检出的267株病原菌中，金黄色葡萄球菌98株，占36.70%；无乳链球菌65株，占24.34%；停乳链球菌57株，占21.35%；大肠埃希菌43株，占16.10%；其他菌4株，占1.5%。4种病原茵对丁胺卡那霉素、环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻肟以及万古霉素均高度敏感，但对青霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素等具有较强的耐药性，因此丁胺卡那霉素、环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻肟以及万古霉素可以作为吉林省奶牛乳房炎治疗的首选药物。

奶牛乳房炎；病原菌鉴定；药敏试验

奶牛乳房炎是由微生物或物理、化学因素等刺激奶牛乳腺组织所发生的一种炎症疾病，其特点是乳汁理化性质以及乳腺组织病理学均发生变化，对机体影响较大[1]。该病是机体常见病，也是多发病，可以导致患病奶牛产奶数量下降、奶品质下降、繁殖能力降低、死淘率增加、治疗费用增加、劣质奶牛危害人体健康等一系列不良后果，严重制约奶牛养殖业发展[2]。我国奶牛存栏量1 440万头，奶牛隐性乳房炎的阳性率也在46%～80%之间[3]。吉林省是我国奶牛养殖大省，也是全国重要的奶源基地，目前吉林省奶牛养殖业以大型奶牛场与私营个体奶牛养殖形式为主，养殖规模发展迅猛，但由于饲养管理水平相对较低，奶牛乳房炎阳性率较高，在一定程度上已经成为制约我省奶牛养殖业发展的瓶颈[4]。本文对吉林省多个大型奶牛场200份乳样进行行细菌分离与鉴定，并对其主要致病菌进行敏感药物筛选试验，以期为科学、合理治疗吉林省奶牛乳房炎提供一定技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验对象 吉林省多个奶牛养殖场的200份未经任何药物治疗的乳样，乳样来自200头患病奶牛。

1.1.2 器材与试剂 ①常规培养基。普通营养琼脂培养基、绵羊血液(50 mL/L绵羊鲜血)琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、叠氮钠血培养基、甘露醇高盐琼脂培养基、营养肉汤，按常规方法配制。②细菌鉴定生化管。生化鉴定用微量发酵管购买于北京九州天瑞科技有限公司。③药敏纸片。红霉素、青霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星、氟哌酸、恩诺沙星、庆大霉素、氨苄西林、克林霉素、四环素、头孢噻肟、复方新诺明、阿莫西林以及万古霉素等药敏纸片购自于上海易佰聚经贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备 培养基的制备参照《兽医微生物学》第五版[5]教材进行。

1.2.2 乳样采集 奶牛乳房炎患牛奶样200份，采自吉林省多个大型奶牛场(乳样来自200头患病奶牛)。先用温水清洗待采样乳头，750 mL/L酒精消毒，弃掉头3把奶，采集奶汁10 mL装入灭菌离心管[6]，并做好标记，置-20℃冷冻保存待检。

1.2.3 奶牛乳房炎判断标准 牛乳体细胞数(SCC)推荐分级标准参照国际乳业联合会(IDF)的规定，其中SCC<50万个/mL为健康奶牛；100万个/mL>SCC>50万个/mL为隐性乳房炎；SCC>100万个/mL为临床型乳房炎[7]。

1.2.4 细菌分离培养 待测奶样离心后弃中、上层液体，取底部沉淀物，无菌条件下分别接种于绵羊鲜血琼脂平板培养基和普通琼脂培养基，37℃恒温培养24 h观察菌落形态及大小，挑取不同形态菌落涂片，经革兰染色后镜检。革兰阳性菌(G+)、球菌、葡萄串状样或短链样排列的菌落接种于血液琼脂平板和营养肉汤；G+、球菌、长链状排列的菌落接种于改良爱德华琼脂培养基进行纯培养，37℃培养24 h后转接5 mL/L绵羊血琼脂平板；革兰阴性菌(G-)、短杆菌者接种于营养肉汤进行纯培养，37℃培养24 h后转接伊红美兰琼脂平板。置37℃恒温箱培养24 h后，挑单个菌落分别接种于血清营养肉汤和营养肉汤供生化鉴定用。

1.2.5 细菌生化鉴定 取分离培养的细菌按照种类分别进行生化鉴定，对疑似葡萄球菌的采用甘露醇发酵试验、麦芽糖、葡萄糖、兔血浆蛋白凝固酶试验、七叶苷水解试验及触酶试验等葡萄球菌属细菌生化鉴定管鉴定；对于疑似链球菌的采用400 mL/L胆汁培养试验、马尿酸钠水解试验、七叶苷水解试验及触酶试验等链球菌属的细菌生化鉴定管鉴定；对于疑似肠杆菌科的采用葡萄糖、三糖铁、乳糖、蔗糖、吲哚、明胶水解试验、甘露醇、甲基红、硫化氢、VP及构橼酸盐发酵试验等肠杆菌科生化鉴定管鉴定。

1.2.5 药敏试验 药敏试验采用纸片扩散法[8]，用微量移液器吸取稀释好的各种菌液各200 μL滴于血清琼脂平板上，用经过灭菌处理的L型玻璃棒均匀涂布菌液，加盖静置15 min待干燥，用镊子将药敏纸片平放于血清琼脂平板上轻轻压紧后勿动，置37℃温箱培养24 h～48 h后观察试验结果，测定抑菌圈平均直径，根据药敏判定标准判断病原菌对药物的敏感性[9]。

2 结果

2.1 乳样中细菌分离及鉴定结果

从200份乳样中分离出267株细菌，采用病原菌的分离、纯化以及生化鉴定方法判定感染病原菌的类型。细菌鉴定结果依据文献[5]见表1，金黄色葡萄球菌98株，占36.70%；无乳链球菌65株，占24.34%；停乳链球菌57株，占21.35%；大肠埃希菌43株．占16.10%；其他菌4株，占1.50%。可见金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌以及大肠埃希菌为吉林省奶牛乳房炎致病优势菌。

2.2 敏感药物筛选试验结果

选用红霉素、青霉素以及链霉素等15种药物对检测出的5种病原菌进行敏感药物筛选试验(表2)，结果显示，各种病原菌对青霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素以及氨苄西林均产生较强的耐药性，而丁胺卡那霉素、环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻肟以及万古霉素对各种病原菌均有较强的抑制作用和杀灭作用，因此治疗吉林省奶牛乳房炎的优选药物为环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻肟以及万古霉素等。

表1 乳样中细菌检测结果

Table 1 Bacterial detection results in milk samples

病原菌Pathogen菌株数 Strainnumber所占比率/%Proportion金黄色葡萄球菌S.aureus9836.70无乳链球菌S.agalactiae6524.34停乳链球菌S.dysgalactiae5721.35大肠埃希菌E.coli4316.10表皮葡萄球菌S.epidermidis41.50合计Total267100

3 讨论

检测的乳样大部分来源于吉林省各大奶牛养殖场以及一少部分来自于散养户，采样具有广泛的代表性。众所周知，乳房炎是奶牛养殖业的常见病和多发病，会造成较大经济损失，产奶牛下降、奶品质量下降影响人体健康，严重制约着奶牛养殖业的发展。奶牛乳房炎主要病原体为细菌、真菌、支原体以及病毒，对采集的乳样进行细菌分离鉴定，共分离出5种病原菌，分别为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌以及停乳链球菌，占致病菌总数的82.40%。大肠埃希菌对奶牛乳房炎的发生也有较强的致病作用，与尹柏双等[10]报道一致。研究表明，吉林省奶牛乳房炎的主要病原体为金黄色葡萄球菌、链球菌以及大肠埃希菌，这几种细菌均为环境和机体常见菌，说明养殖环境和饲养管理水平对于奶牛乳房炎意义重大，因此加强环境消毒、合理免疫、注意奶牛卫生操作、加强乳房保健以及科学合理饲养对于防控奶牛乳房炎具有重要意义。

表2 不同药物对各种病原菌的平均抑菌直径(mm)

Table 2 Average inhibition diameters of different drugs to various pathogens (mm)

药物Drugs金黄色葡萄球菌S.aureus无乳链球菌S.agalactiae停乳链球菌S.dysgalactiae大肠埃希菌E.coli表皮葡萄球菌S.epidermidis红霉素Erythromycin10.51±1.423.64±1.493.57±1.278.04±2.3412.07±2.04青霉素Penicillin8.47±1.367.39±1.047.98±1.578.24±1.088.06±1.19链霉素Streptomycin9.47±0.437.65±1.377.86±1.2815.67±1.349.27±1.38丁胺卡那霉素AmikacinCiprofloxacin21.04±0.9621.49±0.9423.07±1.0723.59±2.0620.67±1.29环丙沙星ciprofloxacin24.42±1.0627.08±0.9727.94±1.3417.94±1.3924.75±2.64氟哌酸Norfloxacin15.47±1.3116.48±1.2715.67±1.0576.47±1.3218.97±1.28恩诺沙星Enrofloxacin26.34±1.5925.37±1.2425.98±2.3019.24±2.0627.04±1.35庆大霉素gentamicin10.37±1.4710.58±1.3910.49±1.2112.94±1.3713.67±096氨苄西林ampicillin10.53±1.5110.57±1.678.34±1.2916.89±1.4212.46±1.81克林霉素Clindamycin14.47±0.8615.89±1.1817.05±0.9114.24±1.2616.36±1.29四环素Tetracycline16.47±1.724.58±1.074.37±1.796.94±1.2116.14±2.04头孢噻肟Cefotaxime28.97±1.5823.57±1.6124.08±2.0420.36±1.6427.64±1.69复方新诺明Cotrimoxazole16.47±0.9115.59±1.7614.87±1.2613.29±2.0717.61±0.79阿莫西林Amoxicillin14.31±1.0912.54±1.2413.95±1.0718.28±1.9414.96±1.62万古霉素vancomycin20.59±1.2717.89±1.2518.35±1.7819.16±1.6720.78±1.82

注：数据采用5次试验的平均值±标准误表示。

Note：The data represent mean ± SD of five tests.

从敏感药物筛选试验结果来看，常用抗菌药的效果均不好，这与平时的治疗习惯关系密切。对于奶牛乳房炎的常规治疗大多采用青霉素结合链霉素治疗，长期不合理、不规范、不科学使用抗菌药会引起机体产生耐药性[11-14]，而红霉素、庆大霉素以及氨苄西林在一定时间、一定区域内一度作为抗炎的首选药物，因此奶牛机体会对以上药物产生较强的耐药性；丁胺卡那霉素、环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻肟在平时治疗奶牛疾病时应用较少，抗菌谱相对较窄，奶牛对以上抗生素相对敏感，试验结果同时表明，同类抗生素在应用时效果相同一致，不同类型的抗菌药之间效果差异显著。在应用抗生素治疗奶牛乳房炎时要注意抗生素的药理属性以及应用范围，除了要考虑机体耐药性因素，还要考虑抗生素的其他副作用，如药物残留、对机体内环境的破坏以及对机体组织器官的损伤等[15-16]，因此，中药治疗奶牛乳房炎应该是未来研究的重点和热点。

对吉林省各大奶牛场的乳样通过细菌分离鉴定，确定吉林省奶牛乳房炎的主要致病菌为金黄色葡萄球菌、链球菌以及大肠埃希菌，这些致病菌对丁胺卡那霉素、环丙沙星、恩诺沙星、头孢噻肟以及万古霉素高度敏感，可以作为吉林省奶牛乳房炎治疗的优选药物，但抗生素治疗奶牛乳房炎存在一定的安全隐患，选择一种安全有效的治疗方法任重而道远。

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Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test of Pathogenic Bactcria Causing Dairy Cow Mastitis in Jilin Province

HAO Jing-feng1,LI Jing-ji1,ZHANG Yu-hang1,YIN Bai-shuang1,FU Lian-jun1,HUANG Yan1,LI Xin-wei2,LI Xiao-bing2,ZHAO Chen-xu2,LIU Guo-wen2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalScienceandTechnologyUniversity,Jilin,Jilin，131102,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin，130062,China)

To know about incidence of dairy cow mastitis in different regions of Jilin province and provide a theorical foundation for comprehensive prevention and control of dairy cow mastitis. 200 milk samples from cow farms in Changchun,Jilin,Baishan and Yanji were collected,and the main pathogens were identified and then used for drug sensitivity test.The results showed that theE.coli,S.aureus,S.agalactiaeandS.dysgalactiaeare the main pathogens causing dairy cow mastitis.And 267 strains of bacteria were isolated from the milk samples,98 strains among them areS.aureus(36.70%), 65 areS.agalactiae(24.34%),57 areS.dysgalactiae(21.35%),43 areE.coli(16.10%)and others are 1.5%.Four kinds of pathogenic bacteria were highly sensitive to amikacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, cefotaxime and vancomycin,but were completely resistant to penicillin, streptomycin, erythromycin, gentamicin,therefore,amikacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, cefotaxime and vancomycin can be primary drugs for treatment of cow mastitis in Jilin province.

dairy cow mastitis;pathogen identification;drug sensitivity test

2016-05-05

吉林省科技厅重点科技攻关项目(20150204024NY)；吉林省教育厅项目(吉教科合字[2016]第205号)；国家级大学生创新项目(201611439025)；吉林农业科技学院重点学科项目(吉农院合字[2015]第X50号)

郝景锋(1977-)，男，黑龙江甘南人，博士研究生，讲师，主要从事临床兽医学研究。 *通讯作者

S857.26

B

1007-5038(2016)12-0126-04