叶青华，吴 巧，岳 华*，储 倩

(1.成都农业科技职业学院，四川成都 611130；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

鸡冷诱导RNA结合蛋白基因序列分析及组织表达

叶青华1，吴 巧2，岳 华2*，储 倩2

(1.成都农业科技职业学院，四川成都 611130；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

为研究鸡冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因的结构特征和组织定量分布情况，根据GenBank中原鸡CIRP基因(NM-001031347)的编码区序列自行设计引物，从健康雏鸡脾脏中扩增青脚麻羽鸡CIRP基因的编码区(CDS)并进行生物信息学分析；设计引物建立实时荧光定量RT-PCR，检测CIRP mRNA在雏鸡各组织器官中的分布及相对表达水平。结果显示,鸡CIRP基因CDS区全长573 bp，编码190个氨基酸，其氨基端包含一个RNA结合域，羧基端富含RGG重复序列，推导的多肽链羧基端比鸭、斑胸草雀及哺乳动物要多18个氨基酸；CIRP基因在鸡各被检组织器官中均有表达，相对表达水平由低到高分别为法氏囊、肺脏、胰腺、胸腺、脾脏、睾丸、盲肠扁桃体、心脏、脑、肾脏、哈德氏腺、肝脏。本研究为进一步探讨鸡CIRP基因的遗传进化及其在病原感染中的作用提供了参考。

鸡；冷诱导RNA结合蛋白；生物信息学分析；组织定量分布

冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA binding protein,CIRP或CIRBP)是一个18 ku的蛋白，属于RNA结合蛋白异源核糖核蛋白亚群[1]。CIRP最初是在研究紫外线辐射引起DNA损伤的转录反应时发现的，它以一种剂量依赖增殖方式参与对紫外线辐射的转录应答[2-3]，随后Nishiyama H等[4]又从小鼠睾丸细胞中分离得到了CIRP的cDNA，并证实CIRP与冷应激有关。大量研究表明，CIRP在多种细胞类型中均有表达，参与对H2O2[5]、缺氧[6]、渗透压[7]等应激的转录应答，并且对上述多种应激状态下的细胞具有保护作用[8-9]，同时参与神经调节[10]和生物钟调节[11]等生理过程。CIRP在细胞抗凋亡过程中对丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases，MAPK) 级联中的ERK通路、核因子κB(NF-κB)通路也有着显著的调控作用[12]。研究显示，抑制CIRP的表达能促进多种癌细胞凋亡，并增加对化学治疗药物的敏感性，表明CIRP是一个潜在的癌症治疗新的分子靶点[13-14]。有研究表明，在LPS刺激和败血症情况下，CIRP通过调节NF-кB信号通路影响多种炎性因子的产生[15]，并通过调节TRL4促进炎症发生[16]，是一种新的促炎介质[17]，在细菌感染中发挥重要作用。但国内外对CIRP的研究主要集中在哺乳动物，未见禽类CIRP的相关研究报道。本研究旨在克隆鸡CIRP基因的编码序列区(coding sequence region,CDS)，分析鸡CIRP基因的序列结构特征，并检测其组织定量分布情况，为深入开展鸡CIRP在病原感染过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 10日龄青脚麻羽鸡，成都农业科技职业学院实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 Trizol试剂，Invitrogen公司产品；DH5α感受态细胞、DNA纯化回收试剂盒，北京天根生物有限公司产品；ExTaq酶试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、PrimescriptTM RT试剂盒和pMD19-T vector试剂盒,TaKaRa公司产品。

1.2 方法

1.2.1 鸡CIRP基因CDS区的克隆及序列分析 根据GenBank中登录的原鸡CIRP基因(NM-001031347)的编码区序列自行设计一对特异性引物，上、下游引物依次为：GC-F：5′-ATGGCATCGGATGAGGG-3′；GC-R：5′-TCACAACAGGGTCA-3′，预期扩增片段为573 bp。采用Trizol试剂提取雏鸡脾脏总RNA，按反转录试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA为模板，用GC-F、GC-R引物PCR扩增鸡CIRP基因CDS区，采用25 μL反应体系：10×ExTaqbuffer 2.5 μL，MgCl22 μL，dNTP Mixture 2 μL，上、下游引物各 1 μL，ExTaq0.15 μL, cDNA 2 μL，ddH2O 14.35 μL。采用自行优化的Touch Down法：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s， 72℃ 30 s，5个循环；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，5个循环；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，5个循环；95℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 30 s，5个循环；95℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 30 s，5个循环；72℃ 10 min，16 ℃结束反应。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化回收试剂盒回收纯化并连接至pMD19-T载体过夜，然后将连接产物转化进入DH5α感受态细胞中送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果用BioXM2.6进行序列分析，用DNA Star进行同源性分析，用MEGA5.0建立进化树，用ProtParam软件分析其编码蛋白的理化参数，用Tmpred软件预测蛋白质的跨膜区，用PSORT Ⅱ程序预测蛋白的亚细胞定位，用SMART程序分析编码蛋白的功能结构域。

1.2.2 鸡CIRP基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立 根据GenBank中登录的原鸡CIRP基因(NM-001031347)序列自行设计1对特异性引物：CIRP-F: 5′-TCTCGCCCGTAAGAACCAATC-3′;CIRP-R:5′-AGAAGC-TACTGCGCTACCGTGT-3′，扩增鸡CIRP基因215 bp片段。采用SYBR GreenⅠ染料法，在ABI 7300实时荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。以最小的Ct值和最高的荧光值为标准，分别对循环条件、退火温度、引物浓度进行优化，建立检测鸡CIRP mRNA的实时荧光定量PCR方法。

1.2.3 定量检测鸡CIRP基因的组织分布 选用10日龄鸡(n=5)作为试验对象，分别采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、睾丸、胰腺、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、盲肠扁桃体，按说明书分别提取各组织器官的总RNA并反转录成cDNA。采用本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测雏鸡各组织中CIRP基因，分析其组织定量分布情况，以本实验室筛选出的在生理状况下稳定的RPL4基因作为内参[18]，以2-△△Ct法[19]计算各组织器官中CIRP基因的相对表达水平。

2 结果

2.1 鸡CIRP基因CDS的序列分析

从鸡脾脏中扩增出一条约573 bp 的片段(图1)，与预期大小相符。测序结果显示，克隆得到鸡CIRP基因CDS区序列与GenBank中登录的原鸡CIRP(NM-001031347)基因序列除了在第9位(由G变为A)和第306位(由C变为T)核苷酸发生无意义突变外，其他序列均吻合。鸡CIRP基因编码190个氨基酸，编码的多肽链包含18种标准氨基酸，其中甘氨酸数目最多，其次是丝氨酸，不含组氨酸和脯氨酸。BioXM2.6对比分析鸡、鸭、斑胸草雀、人和小鼠CIRP的氨基酸序列发现，鸭和斑胸草雀CIRP编码171个氨基酸，人和小鼠CIRP编码172个氨基酸，而鸡CIRP基因则在其编码区的511碱基处密码子AAA替代终止密码子TAA，致使其在羧基末端多编码出18个氨基酸。和已经报道的鸟类(原鸡、鸭、斑胸草雀)一样，鸡CIRP基因与哺乳动物相比在148位少1个氨基酸。

M.DNA 标准DL 2 000;1～2.鸡CIRP基因编码区PCR扩增目的片段

M.DNA Marker DL 2 000;1-2.PCR products of chicken CIRP CDS

图1 鸡CIRP基因编码区序列的PCR扩增结果

Fig.1 Amplification results of chicken CIRP CDS by PCR

同源性分析表明GenBank上仅有的3个鸟类CIRP基因无论在核苷酸结构上，还是在氨基酸结构上与哺乳动物类都是种属间高度保守的。鸡CIRP基因的CDS区核苷酸序列及编码氨基酸序列与鸭、斑胸草雀、仓鼠、人、家鼠、猩猩、褐家鼠、猪、爪蟾、斑马鱼的同源性分别为88.8%、86.8%、72.8%、73.0%、73.0%、73.4%、73.6%、60.7%和31.4%和96.5%、95.9%、83.1%、83.7%、83.1%、83.7%、82.6%、84.3%、62.7%和14.2%。系统进化分析结果显示，鸡、鸭、斑胸草雀3个鸟类属于同一分支，人、仓鼠、猩猩等哺乳动物属于另一分支，鸟类CIRP与哺乳动物类CIRP遗传距离较近，与爪蟾和斑马鱼的遗传距离较远(图2)。

通过Protparam软件对鸡CIRP理化性质的分析可知，鸡CIRP的相对分子质量约为21 ku，理论pI为9.74，半衰期为30 h，不稳定系数为35.05，该值小于40即为稳定性蛋白[20]，由此判断鸡CIRP为稳定性蛋白；总平均亲水性为-0.948，说明鸡CIRP整体呈现亲水性，是可溶性蛋白[21]。Tmpred和PSORT Ⅱ软件分析显示,鸡CIRP不存在跨膜结构域，该蛋白应是一种存在于细胞核的蛋白质。采用SMART在线软件预测到鸡CIRP氨基端含有一个RNA结合域。

2.2 鸡CIRP mRNA实时荧光定量RT-PCR

鸡CIRP基因的扩增曲线与熔解曲线见图3，扩增曲线平滑，熔解曲线为单一性峰，证明此荧光方法扩增效率和特异性良好。优化的反应体系为20 μL：SYBR GreenⅠ10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物分别为0.3 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7 μL。优化的反应条件： 95℃，3 min；95 ℃，30 s；59℃，31 s，共40个循环。 熔解温度为83.1℃±0.5℃。

2.3 鸡CIRP基因的组织定量分布

通过实时荧光定量RT-PCR检测得到各组织器官中CIRP mRNA及RPL4 mRNA的Ct值，以RPL4作为内参基因，采用2-△△Ct方法计算各组织器官中CIRP基因的相对表达水平。以表达量最低的组织器官中的CIRP表达量为1，其余组织器官中CIRP基因的相对表达水平则是其与表达量最低的组织器官中CIRP表达水平的比值。由图4可知，CIRP在鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、睾丸、胰腺、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、盲肠扁桃体等组织器官中广泛表达。其中，肝脏中相对表达水平最高，哈德氏腺次之，法氏囊中相对表达水平最低。

3 讨论

3.1 鸡CIRP基因的结构特征

本研究克隆得到的鸡CIRP基因编码区序列与GenBank中登录的原鸡CIRP(NM-001031347)基因序列除了在第9位(由G变为A)和第306位(由C变为T)核苷酸发生无意义突变外，其他序列均吻合，这显示了克隆结果的准确性。鸡CIRP基因编码190个氨基酸，与鸭、斑胸草雀、人和小鼠相比存在显著的不同，在其编码区的511碱基处密码子AAA替代终止密码子TAA，使翻译在羧基末端多编码出18个氨基酸，多出来的部分是否会影响CIRP的基因功能有待进一步研究。CIRP在脊椎动物中是高度保守的，但遗传进化树结果表明，GenBank上仅有的3个鸟类(鸡、鸭、斑胸草雀)单独聚为分支，哺乳动物类聚为另一支，对比两物种的氨基酸序列发现最大的区别在于鸟类的148位氨基酸处比哺乳动物类都要少1个氨基酸，这一发现为研究鸟类CIRP的遗传进化提供了参考。

图2 CIRP基因的系统进化分析

图3 鸡CIRP 基因扩增曲线和熔解曲线

图4 鸡CIRP基因的组织定量分布

已有研究表明[22]，人和小鼠CIRP基因编码172个氨基酸，包含两个确定的结构域：1-85位氨基酸为RNA结合域(consensus sequence RNA-binding domain，CS-RBD)；86-172位氨基酸为羧基末端甘氨酸富集结构域(RGG motif，R-精氨酸，G-甘氨酸)。CS-RBD是主要的RNA结合基序之一，包含两个高度保守的序列：一个八聚体的RNP1和一个六聚体的RNP2。CIRP的CS-RBD包含RNP1和RNP2的共有序列以及许多高度保守的片段，可以很好地与其他有机体蛋白的CS-RBD结合[22]。羧基末端RGG结构域可以增加RNA同其他RBD非特异性的亲和性及序列特异的RNA结合活性[23]。此外，羧基端RGG 区域的精氨酸残基的甲基化作用也是CIRP从细胞核向细胞质移动所必需的[9]。本研究采用SMART软件预测到鸡CIRP基因氨基端包含了一个RNA结合域，对比发现鸡CIRP与人CIRP的RNA结合域完全相同。另外，我们也发现鸡CIRP羧基端结构与人CIRP羧基端结构类似，包含许多重复的RGG序列，RGG序列中影响CIRP核质迁移过程的3个精氨酸甲基化位点(R94、R105、R116)不存在任何变化。CIRP向应激颗粒移动可能通过其RNA结合域或RGG结构域介导，而CIRP的RGG结构域中精氨酸残基的甲基化作用是CIRP出核转运和随后在应激颗粒中积累所必需的[9]。因此，我们推测在一些应激条件下鸡CIRP与人CIRP的核质迁移过程可能是相同的。

3.2 鸡CIRP基因实时荧光定量RT-PCR

实时荧光定量RT-PCR具有灵敏度高、重复性好、特异性强、速度快、通量高、无需PCR后电泳等特点,已成为基因定量检测的金标准[24]，被广泛应用于基因表达水平的研究。本研究首次建立了鸡CIRP基因的实时荧光定量RT-PCR，该方法的扩增曲线平滑，熔解曲线为单一性峰，证明此实时荧光定量RT-PCR具有良好的扩增效率和特异性。在研究不同样本之间基因表达量的变化时，很难保证样本之间细胞数量的一致，以及在核酸提取和RNA反转录过程中也很难保证各样本之间的一致性，因此，需要内参基因进行相对定量分析来消除这些误差。本研究利用生理状况下稳定的内参基因RPL4[18]对检测结果进行标化，消除试验方法及功能状态等因素带来的表达差异，保证了定量结果的准确性，为鸡CIRP mRNA转录水平的研究提供了有用的检测手段。

3.3 鸡CIRP基因的组织定量分布

CIRP最初是在睾丸中被分离鉴定，是一种重要的多功能蛋白，在多种组织器官中发挥作用。Zhou M等[17]采用外科手术造成雄性Balb/c小鼠隐睾症，并通过体内电穿孔技术将CIRP基因转移到隐睾症小鼠的睾丸中，通过RT-PCR和Western blot 验证了CIRP的过表达可通过下调p53和Fas的水平而减少隐睾症引起的睾丸损伤。此外，CIRP在睾丸中对于维持小鼠精子的发生过程也起着至关重要的作用[25-26]。研究表明CIRP在原肠胚时期与爪蟾的神经组织发育密切相关[10-11]。在温和低温时，CIRP还可以通过诱导硫氧环蛋白表达而抑制H2O2诱导的大鼠皮质神经元细胞的凋亡，形成一条温和低温时神经元保护通路而发挥神经保护作用[27]。Peng Y等证实母源的x-CIRP1是爪蟾前肾形成过程中所必需的，CIRP在前肾形成过程中发挥重要作用。

目前关于CIRP功能性研究主要集中在睾丸、脑、肾组织器官中，CIRP在这些组织器官中都有分布并且参与了一些重要的生理活动过程。然而关于CIRP在各个组织器官中的定量分布检测未见报道。本研究通过实时荧光定量RT-PCR检测得到各组织器官中CIRP mRNA的表达水平。结果表明，鸡CIRP基因在各组织器官中均有表达，但在肝脏中的表达水平却远远高于其他组织器官。众所周知，肝脏承载着机体的新陈代谢和免疫防御等重要功能，参于了机体对冷应激[28]、损伤[29]和疾病[30]等条件下的应激反应。业已证明，CIRP在机体起始免疫和流感病毒复制过程中发挥重要作用[13-31]，并参与机体对新城疫病毒[32]、细菌内毒素(LPS)[33]的转录应答。本研究结果为深入研究鸡CIRP参与机体对病原感染应答中的作用提供了有价值的参考资料。

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Sequence Analysis and Tissue Expression of Cold-inducible RNA Binding Protein in Chickens

YE Qing-hua1,WU Qiao2,YUE Hua2,CHU Qian2

(1.ChengduVocationalCollegeofAgricultralScienceandTechnology,Chengdu,Sichuan,611130,China；2.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China)

To study the structural features and quantitative distribution of chicken CIRP gene in chicken tissues,according to the jungle fowl CIRP gene sequence in GenBank (NM-001031347),the primers were designed.The coding sequence region (CDS) of partridge shank chicken CIRP gene was cloned,sequenced and then analyzed.Real-time RT-PCR was developed for detecting the relative expression levels of CIRP gene in various tissues and organs of the chicks.The results showed that CIRP gene CDS in chicken was 573 bp,which encoding 190 amino acids,containing a N-terminal RNA binding domain and C-terminal arginine-glycine-rich (RGG) repeats,and the terminal polypeptide chain carboxyl group has 18 amino acids more than that in the duck, zebra fish and mammals.CIRP mRNA existed in all detected tissues and organs.The relative expression levels elevated as following: bursa of Fabricius,lung,pancreas,thymus,spleen,testis,cecal tonsil,heart,brain,kidney,Harder's gland,liver.Analysis of chicken CIRP gene structural features and quantitative study on the tissue distribution could provide a reference for further studying its genetic evolution and further exploring the role in the infective process.

chicken;cold-inducible RNA binding protein;bioinformatics analysis;quantitative distribution in tissue

2016-04-05

四川省教育厅创新团队项目(13TD0057)

叶青华(1970-)，女，甘肃民勤人，副教授，硕士，主要从事动物疫病防治研究 。*通讯作者

S852.321;Q789

A

1007-5038(2016)12-0028-06