马 芹 ， 宋甲宝 ， 王方正 ， 孙月萍 ， 刘文华

(青岛农业大学动物科技学院 ， 山东青岛266109)



鸭源致病菌的分离鉴定及耐药性分析

马 芹 ， 宋甲宝 ， 王方正 ， 孙月萍 ， 刘文华

(青岛农业大学动物科技学院 ， 山东青岛266109)

从临床发病鸭中分离到的57株细菌进行了鉴定和药敏检测。通过常规培养和生化试验鉴定出11株大肠杆菌；通过16S rRNA基因的PCR扩增和测序确诊了13株沙门菌和33株鸭疫里默菌。纸片法药敏试验结果显示，分离菌株对20种抗菌药物有不同程度的耐药性。利用PCR方法检测了喹诺酮类、β-内酰胺类等耐药基因在分离株的分布情况，结果显示，纸片扩散法检测的菌株的耐药表型与耐药基因并非完全一致，耐药菌株中有60%以上的菌株能检测到相应的耐药基因。

大肠杆菌 ； 沙门菌 ； 鸭疫里默菌 ； 耐药性检测

目前在肉鸭养殖中，大肠杆菌、沙门菌和鸭疫里默菌是临床最常见的细菌性感染，并往往表现为混合感染，发病率和死亡率极高，临床上细菌的耐药情况日益严重。3种致病菌感染的某些症状相似，单纯通过临床观察很难鉴别开来。因此，分离致病菌并通过实验室手段进行鉴定，对了解鸭源细菌性感染情况具有重要意义。通过检测分离菌株的耐药性和耐药基因的存在可对指导临床用药提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌单因子阳性血清(O1、O2、O3、O6、O8、O15、O17、O18、O22、O28、O36、O107)，购自中国兽医药品监察所；引物由华大基因科技服务有限公司合成；其他试剂由青岛农业大学兽医微生物学实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 从山东临沂、潍坊等地区送检的病鸭分别取其脑、肝、心等组织进行细菌分离，分别接种麦康凯培养基、S.S.培养基和含2%小牛血清的TSA培养基37 ℃培养24 h观察结果。其中在麦康凯培养基上形成中等大小、表面光滑湿润的红色菌落者判定为疑似大肠杆菌；在S.S.培养基上形成表面光滑的黑色菌落判定为疑似沙门菌；在麦康凯和S.S.培养基上不生长，但在TSA培养基上会形成生长良好的无色透明菌落者判定为疑似鸭疫里默菌。

1.2.2 形态观察及生化试验 挑取单菌落进行革兰染色镜检。并进行以下生化反应：糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验、V-P试验、枸橼酸盐试验和尿素酶试验，具体操作参照文献[1]。

1.2.3 沙门菌和鸭疫里默菌的PCR鉴定 通过16S rRNA 基因的PCR扩增鉴定分离的疑似沙门菌菌株；通过外膜蛋白序列扩增鉴定疑似鸭疫里默菌[2]。将扩增产物送华大基因科技服务有限公司测序。1.2.4 血清型鉴定 利用单因子阳性血清进行玻片凝集，鉴定大肠杆菌和鸭疫里默菌菌株的血清型[3]。

1.2.5 纸片法药敏试验 利用庆大霉素、头孢曲松钠、氟苯尼考等20种抗菌药物对57株分离菌进行K-B纸片扩散法药敏试验[4]。

1.2.6 耐药基因的检测 为了检测纸片法药敏试验结果与相应耐药基因的相关性及多重耐药的存在情况，首先根据纸片法药敏试验结果，在耐β-内酰胺类药物的分离菌株中随机抽取5株沙门菌、4株大肠杆菌和16株鸭疫里默菌进行相关耐药基因检测。采用煮沸法制备细菌DNA模板[5]，参照相关文献[6-7]分别合成了针对β-内酰胺酶基因、抗喹诺酮类药物的DNA螺旋酶基因、抗氨基糖苷类药物的钝化酶基因、氟苯尼考耐药基因的11对引物进行耐药基因的PCR扩增，并将扩增产物送华大基因科技服务有限公司测序。

2 结果

2.1 细菌的分离培养结果 通过观察细菌在不同平板上的培养特性、形态特点和生化反应特征，初步确定其中11株为大肠杆菌，13株为沙门菌。

2.2 沙门菌的16S rRNA基因扩增和鉴定结果 沙门菌菌株的16S rRNA基因PCR扩增结果见图1。通过测序及序列比对，其中11株鉴定为肠炎沙门菌，另外2株鉴定为鸡白痢沙门菌。

图1 16S rRNA 基因片段扩增

M：DL-2 000 DNA分子量；1～4分别为4株临床

沙门菌分离株的16S rRNA基因片段扩增结果

2.3 鸭疫里默菌的外膜蛋白基因片段的扩增 部分疑似鸭疫里默菌的PCR扩增结果见图2。33株鸭疫里默菌临床分离株均获得预期660 bp大小的条带，通过测序比对，确定为鸭疫里默菌。

2.4 血清型鉴定 通过玻片凝集试验对分离的11株大肠杆菌和33株鸭疫里默菌进行了血清型鉴定，结果表明，8株大肠杆菌分属O6(2株)，O36(2株)，O78(2株)，O17(1株)，O18(1株)5个血清型，有3株未定型；33株鸭疫里默菌临床分离株中鉴定为血清1型的有11株，血清2型的有5株，其他菌株未定型。

图2 外膜蛋白基因片段扩增图谱

M：DL-2 000 DNA分子量；1～3分别是3株RA

临床分离株的外膜蛋白基因片段扩增结果

2.5 纸片法药敏试验结果 参照CLSI药敏试验标准，57株细菌对20种抗生素的耐药情况见表1。

表1 57株细菌的纸片法药敏试验结果

上述试验结果表明，57株分离菌对20种抗生素均有不同程度的耐药性，其中大肠杆菌和沙门菌对大环内酯类和林可霉素类药物的耐药率达到了100%，鸭疫里默菌对氨基糖苷类药物的耐药率 超 过了 50%，大多数分离菌株表现为多重耐药。2.6 耐药基因的检测 在耐药基因检测过程中，扩增到了与 OXA、IMP、SHV、TEM、CTX-M、aac(3)-II、ant(3″)-I、gyrA、floR基因预期大小一致的目的条带，并通过测序确定了耐药基因的正确性。而aac(3)-I、aph(3′)-IV基因引物未能扩增到预期大小的目的条带。将药敏结果和耐药基因检测结果比较分析见表2。

由表2可知，纸片扩散法检测的菌株的耐药表型与相应耐药基因并非完全吻合，但绝大多数耐药菌株中能检测到含有相应的耐药基因。未检测到耐药基因的菌株很可能具有其他的耐药机制。

表2 耐药菌株数与含耐药基因的菌株数的比较

3 讨论

3.1 细菌的血清型 通过玻片凝集试验对分离到的大肠杆菌和鸭疫里默菌进行了血清型的鉴定。仅从检测情况来看，8株定型大肠杆菌菌株分别属于5个不同的血清型，说明鸭源大肠杆菌血清型分布的广泛性；而从鸭疫里默菌分离株已鉴定血清型来看，1型所占比例达到33%以上，仍为流行的优势血清型。由于实验室保存的单因子阳性血清种类不全，未能鉴定出所有大肠杆菌和鸭疫里默菌分离株的血清型。

3.2 耐药性检测 在纸片法药敏试验检测结果中，57株细菌对20种抗菌药物的耐药性不同，临床耐药表现与耐药基因的相关性与其他报道的结果也存在差异[8-9]，这可能因为不同地区耐药基因的流行和分布情况不同，使得耐药性与耐药基因两者之间的相关性不完全相同。在耐药基因的检测过程中，发现有极个别无耐药表型的菌株也能检测出耐药基因，如试验中2株表现为耐β-内酰胺但不耐氨基糖苷类药物的菌株检测到了抗氨基糖苷类基因，这可能是因为该耐药基因因受某些因素的影响而成为沉默基因，没有表达应有的表型。另外，一部分菌株尽管表现出了耐药性，但是没有检测出相应的耐药基因，由于本试验只对部分耐药基因进行了初步鉴定，不排除菌株含有其他耐药基因或存在其他耐药机制的情况。

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2015-08-19

青岛农业大学大学生科技计划项目-山东省鸭传染性浆膜炎流行病调查及病原耐药性检测(201410435010)

马芹(1990-)，女，本科生，就读于动物医学专业，E-mail：542446515@qq.com

刘文华，E-mail：wenhualiu2668@126.com

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0529-6005(2016)10-0080-03