王 好 ， 刘丽凡 ， 于 丹 ， 王友超 ， 周井祥

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118 ；2.长春市动物疫病预防控制中心 ， 吉林长春130061)



桉液对锦鲤疱疹病毒细胞内复制影响的试验

王 好1， 刘丽凡1， 于 丹2， 王友超1， 周井祥1

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118 ；2.长春市动物疫病预防控制中心 ， 吉林长春130061)

本试验使用细叶桉树的树叶制备成的桉液作为病毒致弱的试剂，将不同稀释度的桉液分别作用于锦鲤鳍条细胞系和在锦鲤鳍条细胞系复制的锦鲤疱疹病毒。结果表明，桉液浓度越高KF-1细胞增殖越困难。桉液浓度低于1∶400时，对细胞生长无明显影响。当桉液浓度在1∶400时，其病毒抑制率达到77.2%。用统计软件SPSS11.5的Linear-regression分析直线回归方程为，y=0.375x+6.264，R=0.971，P<0.05。说明桉液的浓度与病毒抑制率间有相关直线关系。即药物浓度越高，抑制病毒增殖的能力越强，其量效关系表现显著。

锦鲤疱疹病毒 ； 锦鲤尾鳍细胞系 ； 桉液

锦鲤疱疹病毒病(Koiherpesvirusdisease，KHVD)，是严重威胁鲤和锦鲤养殖业安全的一种世界性疾病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的疾病，我国将其列为二类动物疫病。病原隶属于疱疹病毒目(Herpesvirales)异样疱疹病毒科(Alloherpesviridae)鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)成员[1]。KHV 传染性强，该病目前尚无有效的治疗方法。

接种疫苗可能是一种控制锦鲤疱疹病毒病发生的容易想到的办法，临床上用KHV 制备的灭活苗或者核酸疫苗以及亚单位疫苗效果都不能让人满意。还不能推向市场。而减毒苗已经应用于临床，用来预防和控制本病，收到了比较好的免疫效果[2-3]。

细叶桉(EucalyptustereticornisSmith)为桃金娘科植物，栽培区主要分布在我国南方几省。桉叶中含有大量的有效成分，这些物质具有重要的生理活性[4]。桉叶油的主要化学成分为1，8-桉叶油素、α-崖柏烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、对伞花烃、罗勒烯、异松油烯、α-水芹烯、α-松油烯、柠檬烯、β-石竹烯、香茅醛、橙花叔醇、芳樟醇、反式松香芹醇、松桉叶醇、α-桉叶醇等。研究表明，从桉叶中提取的桉叶油含有大量的抗氧化活性成分，这一功效可以对抗炎抗菌抗病毒起到很大作用[5]。1998 年许淑英等人[6]利用桉叶制备成桉液作用于草鱼出血病病毒(GCHV)，其强毒株毒力逐渐减弱，但免疫原性没有改变，变为弱毒株，成功将GCRV 致弱。本试验采用细叶桉叶的提取液作为致弱病毒的试剂，以期获得KHV致弱毒株。

1 材料与方法

1.1 病毒与细胞 锦鲤疱疹病毒吉林株(KHV-CJ)系由吉林农业大学重点实验室分离保存[7]；锦鲤鳍条细胞系(KF-1)由本实验室培养保存。

1.2 桉液 细叶桉树叶：采自广西省某山区树林中。

制备桉液：将9月份采摘的细叶桉树叶进行清洗后，晾晒在室内阴凉通风处，晾干一段时间后制备桉液。称取100 g桉叶加入1 L超纯水，煮沸10 min。用滤膜孔径为0.45 μm的抽滤器将药液进行抽滤后补足蒸发的水分至1 L，得10%桉叶药液即设定为桉液原液。121 ℃，30 min高压灭菌，保存 4 ℃备用。

1.3 主要试剂 新生牛血清、胰酶、EDTA、青霉素和链霉素、两性霉素B、HEPES、二甲基亚砜(DMSO)、MTT、L-15细胞培养液。

1.4 病毒培养 当KF-1细胞长到细胞培养瓶底部80%～90%时，接种KHV，放置在26℃，5%CO2的细胞培养箱内，同时设置阴性对照组细胞。

1.5 TCID50测定及MTT法测定不同桉液浓度对细胞生长的影响 病毒原液10倍比稀释，细胞长满孔底大约75%～85%时接种病毒。设置设阴性对照组和空白细胞对照。按照Reed-Muench两氏法计算TCID50的效价。

MTT测定法已广泛应用于在检测细胞活力和细胞毒性试验当中。本试验将不同浓度桉液接种细胞观察细胞生长状态来确定桉液最佳稀释浓度。

细胞长成单层后加入含不同稀释浓度的桉液的培养液(含桉液浓度分别为1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)。96 h后，每孔加入含10 μL的MTT(5 mg/mL)的培养液，再持续培养4 h。由于桉液具有氧化还原性可与MTT溶液反应，需先弃去培养液，然后用PBS缓冲液冲洗后加入含MTT的培养液。取出96孔板，每孔加入100 μL的DMSO，置于低速摇床上振荡10 min，使紫色结晶体可完全溶解。在酶标仪上测量OD490nm吸光值。根据下面公式计算细胞存活率。

细胞存活率计算：细胞存活率%=(实验组OD值-调零组OD值)(对照组/OD值-调零组OD值)×100%。

1.6 不同桉液浓度对病毒复制的影响 KF-1长满96孔细胞培养板孔底，接种100个TCID50的KHV病毒液，放置在培养箱内孵育1 h，弃去病毒液。按对细胞无毒桉液浓度(1∶400)，倍比稀释5个稀释浓度，每孔加不同稀释浓度药物的维持液100 μL，每个稀释度设8个重复孔，设置病毒对照孔、细胞对照孔。继续培养并每天观察细胞CPE，5 d后，待病毒孔CPE达到75%～85%时，分别向各孔中加入含10 μL的MTT(5 mg/mL)的培养液，孵育4 h，弃掉，每孔加入100 μL的DMSO，溶解振荡，测OD值，即利用MTT法检测KHV的抑制率。

病毒抑制率%=(实验组OD值-病毒对照组OD值)(细胞对照组/OD值-病毒对照组OD值)×100%。

2 结果

2.1 病毒培养 KF-1细胞是成纤维样细胞，贴壁呈梭形或椭圆形，形态饱满，均匀单层的铺在细胞瓶底部。接种KHV 6～7 d时发生典型病变。接种病毒后的细胞明显收缩变圆，细胞间轮廓不清，崩解的细胞碎片增多，细胞脱落，最典型的病变特点是细胞空泡化(见图1)。

2.2 病毒效价及不同桉液浓度对KF-1细胞的增殖影响 按照Reed-Muench两氏法[6]计算KHV的TCID50=10-6.59。

图1 KHV接种在KF-1细胞上的CPE

A： 正常KF-1细胞 (×100)； B： 接种KHV病变的KF-1细胞 (×100)

桉液稀释浓度分别为1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400作用于KF-1细胞，每24 h通过镜下观察，可以清楚的看出桉液浓度越高对细胞有明显的毒性作用，细胞形态改变、脱落，折光性差，不能正常生长。而桉液浓度低于1∶400时，对细胞生长无明显影响(见图2)。由表1可看出，桉液浓度越高KF-1细胞增殖越困难。因此桉液浓度在1∶400为最高细胞安全生长浓度。

ABC

DEF

不同桉液浓度下的细胞存活率/%1∶101∶501∶1001∶2001∶4001∶800存活率/%29.7137.8858.1683.98100.20103.93

表2 不同桉液浓度对KHV的抑制

2.3 不同桉液浓度对病毒复制的影响结果 将上述KHV 的病毒液(TCID50/0.1 mL=10-6.59)接种于96 孔板上，MTT 法检测KHV 的抑制率。结果显示，KHV 对照组细胞CPE 出现明显。正常对照细胞生长状态良好。加桉液的试验组细胞形态比病毒对照组细胞病变程度要小，仍是成纤维样细胞，仅有少数细胞出现空洞。所以适当浓度的桉液能抑制KHV 在KF-1 细胞内的复制增殖。当桉液浓度达到1∶400 时，其病毒抑制率达到77.2%。用统计软件SPSSll.5 的Linear-regression 分析直线回归方程为，y=0.375x+6.264，R=0.971，P<0.05。说明桉液的浓度与病毒抑制率间有相关直线关系。即药物浓度越高，抑制病毒增殖的能力越强，其量效关系表现显著。

3 讨论

鱼类病毒性疾病一直是全球水产养殖业未解决的难题之一。在滥用抗病毒药物的今天，江河湖泊大多以被这些化学药物污染，鱼类产生抗药性且毒副作用大，以至于疾病大规模暴发之后出现无药可救的局面。这个对于水产养殖业棘手的安全问题日益成为人们关注的热点。然而利用中草药来治疗病毒性疾病却具有得天独厚的优势。中草药属于纯植物药物，本身毒性低，不能产生耐药性还可以增强机体的免疫抵抗力。近些年的一些实验研究表明，中草药已经被许多抗病毒药物的研发应用于临床实践中。在我国中草药种植或采集都很方便，产量丰富，价格低廉也是研究其抗病毒作用的优势之一。

由于中草药组成成分复杂，因此多靶点作用机制才在抗病毒环节中起到有效作用。中草药抗病毒机制大致有两种途径[8]：一是可直接杀灭病毒或是阻断病毒复制过程中的环节，阻止病毒吸附的过程，抑制病毒增殖，并且保护侵入的宿主细胞免受损伤，从而达到杀灭病毒的目的。二是首先通过间接方法利用中草药来增强机体免疫力，如细胞免疫功能和体液免疫功能。这种方法更具有研究意义和更有效的杀灭病毒。细叶桉其叶供药用，可抑制鱼类病毒的功效也随即被发现。但药物成分和药用机理尚未明确，待进一步研究。

本试验同利用MTT 法对KF-1 细胞进行存活率的检测，采用镜下观察CPE 法对各种桉液稀释浓度抗KHV 的效果进行研究。试验结果表明，桉液浓度分别为1∶400 和1∶800 时作用于KF-1 细胞，细胞生长正常，细胞分裂明显，而其他稀释浓度细胞不能正常生长，说明该两种稀释浓度为作用于细胞的安全浓度。通过先感染病毒后孵育药物的方法，利用MTT 试验计算其病毒抑制率，结果表明，将桉液各稀释浓度对KHV 均有抑制作用，但桉液浓度为 1∶400 时的病毒抑制率更高。这与许淑英等人[6]利用细叶桉液将其GCRV 弱化得出的桉液减毒稀释浓度上下有所波动，一是可能作用的两种病毒不同，导致作用机制不大相同。二是可能由于细叶桉的产地不同或是采摘桉叶的季节和月份不一致，导致其药效也会略有不同。由本试验可推断出，桉液浓度为1∶400 时对KF-1细胞毒性更小，抑制KHV增殖更明显。

[1] Waltzek T B，Kelley G O，Stone D M，etal.Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus(CyHV-3)in the family Herpesviridae[J].Journal of General Virology，2005，86(6)：1659-1667.

[2] L R B，H M，S Y.Prevention of a mortal disease of carps induced by the carp Interstitial Nephritis and Gill Necrosis Virus(CNGV)in Israel[J].ull Fish Agen，2005：9-11.

[3] Perelberg A，Ronen A，Hutoran M，etal.Protection of cultured Cyprinus carpio against a lethal viral disease by an attenuated virus vaccine[J].Vaccine，2005，23(26)：3396-3403.

[4] 田玉红，张祥民，黄泰松，等.桉叶油的研究进展[J].食品与发酵工业，2007(10)：139-143.

[5] 王玉堂.疫苗在水产养殖病害防治中的作用及应用前景[J].中国水产，2013(05)：46-48.

[6] 许淑英，李焕林，邓国成，等.草鱼出血病病毒减毒的研究[J].上海水产大学学报，1998(03)：211-216.

[7] 徐先祥，戴岳.中药皂苷抗病毒作用研究概况[J].中药药理与临床，2008(02)：110-112.

Study on intracellular replication Eucalyptus Liquid Koi herpes virus cells

WANG Hao1， LIU Li-fan1， YU Dan2， WANG You-chao1， ZHOU Jing-xiang1

(1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Changchun Centers for Disease Control and Prevention，Changchun 130061，China)

The extract of Eucalyptus tereticornis Smith leaves was used as a reagent to attenuate virus in this experiment，The different dilutions of Eucalyptus were added to the tail KF-1 cell lines to see their effects on Koi herpesvirus replication.The results showed that the higher the concentration of Eucalyptus was used,the less virus prolifevation in KF-1 cells.Eucalyptus concentration less than 1∶400，had no significant effect on cell growth.When eucalyptus dilutiopn was 1∶400，viral suppression rate was 77.2%.Statistical software SPSSll.5 Linear-regression analysis of the linear regression equation showed that，y=0.375x+6.264，r=0.971，(p<0.05).indicating that the concenntration of Eucalyptus and viral suppression had a linear relationship.

Koi herpes virus ； KF-1 ； Eucalyptus liquid

ZHOU Jing-xiang

2015-07-24

长春市科学技术局先进实用技术的示范推广项目(12XN35)

王好(1980-)，男，讲师，博士，主要从事动物病毒分子生物学方面研究，E-mail：wanghao199@126.com

周井祥，E-mail：zhjxnd@126.com

S941.41

A

0529-6005(2016)10-0017-03