新疆和静县部分地区散养户焉耆马梨形虫病的 PCR 诊断

2016-12-21呼尔查哈西巴特李永畅巴音查汗

中国兽医杂志 2016年10期

呼尔查，哈西巴特，李永畅，席耐，巴音查汗

(1.新疆农业大学动物医学院，新疆乌鲁木齐830052 ； 2.新疆巴音郭楞蒙古自治州动物疾病控制与诊断中心，新疆库尔勒841000 ； 3.新疆巴音郭楞蒙古自治州和静县畜牧兽医站，新疆和静841300)

呼尔查1，2，哈西巴特3，李永畅1，席耐2，巴音查汗1

马梨形虫病是寄生于马属动物(马、斑马、驴和骡)红细胞内的通过蜱[2，7，11]传播的血液原虫病，目前已发现的有马泰勒虫[3-5]和驽巴贝斯虫[6，9-10]两种。被梨形虫感染的马属动物发病后出现发热、皮下淋巴结肿大、贫血、黄疸等主要症状，降低动物的劳动力，偶尔会出现死亡病例。该病常出现在3月底至5月中旬，6月至8月份散发与该地区的蜱虫活动密切相关。在巴音郭楞蒙古自治州(简称巴州)主要发生在马养殖较多的县市，和静县[1]最为突出，焉耆马(地方品种马匹总称)为其特色，因近年来焉耆马的存栏量在逐步减少，提高焉耆马饲养数量已是非常重要。马梨形虫病[8]的广泛流行，给巴州马产业带来了严重的考验。随着新疆马产业的健康发展，专业技术人员对该病的认识及研究水平亦在不断提高，正在努力掌握和探索一系列较为先进的诊断和防控技术，为预防、控制马梨形虫病奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料从巴州和静县两个山区乡镇的焉耆马养殖户，共采集了68份全血样品，同时进行血液涂片，经甲醇固定后带回实验室染色。记录马匹年龄与性别，观察马匹体表是否有蜱虫吸血，并一同采集了附着于马匹体表的饱血、半饱血和地面未吸血的蜱虫。

试剂：琼脂糖、溴化乙锭，购自Sigma公司；赛百盛血液基因组DNA提取试剂盒，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；DL-2 000Marker、2×EsTaqMaster Mix(TaKaRa)，购自晶美有限公司。

RADIAL20 台式高速离心机(西班牙 ORTOALRESA 公司)；DK-600A 型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；DYY-III-5 型电泳仪(北京六一公司)；PCR仪(美国 Bio-Rad公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 模板DNA提取从EDTA抗凝管采集的全血样品取出马匹血液，使用北京赛百盛树脂型基因组DNA提取试剂盒，按说明书操作提取马全血基因组DNA。

1.2.2 引物诊断所需的马梨形虫引物由新疆农业大学动物医学院寄生虫实验室赠送。

1.2.3 PCR扩增体系马泰勒虫(25 μL)：dNTPMixture 12.5 μL(TaKaRa)，上下游引物1 μL，模板2 μL，双蒸水 9.5 μL 至终体积 25 μL。混匀后置PCR 扩增仪中，扩增程序为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，引物退火温度为 55 ℃，退火时间30 s，72 ℃延伸 30 s，共 30 个循环后 72 ℃延伸 3 min，最后10 ℃无限时设定。

驽巴贝斯虫(25 μL)：dNTP mixture 12.5 μL(TaKaRa)，上下游引物 1 μL，模板 2 μL，双蒸水9.5 μL至终体积25 μL。混匀后置PCR扩增仪中，扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，引物退火温度为 56 ℃，退火时间 45 s，72 ℃延伸 1min，共 35 个循环后 72 ℃延伸 10 min，最后 10 ℃无限时设定。

2 试验结果

2.1 PCR方法检测马梨形虫感染情况

2.1.1 泰勒虫病部分PCR阳性扩增结果以马泰勒虫Te18S为引物的驽巴贝斯虫特异性引物，目的片段为 512 bp，阴性、阳性对照成立，阴性样品未出现DNA条带，有10个样品出现512 bp左右的扩增条带。共 68 份样品，10 份阳性，阳性率14.7%，见图1。

2.1.2 马驽巴贝斯虫部分PCR阳性扩增结果以BC48为引物的驽巴贝斯虫特异性引物，目的片段为 451 bp，阴性、阳性对照成立，阴性样品未出现DNA条带，有40个样品出现451 bp左右的扩增条带。共68份样品，40份阳性，阳性率58.8%，详见图2。

图1 马泰勒虫Te18S靶基因PCR扩增

M：DNA分子质量标准；1～2：马泰勒虫扩增产物；3：阴性对照

图2 马驽巴贝斯虫BC48靶基因部分阳性PCR扩增

M：DNA分子质量标准；1～2：马驽巴贝斯虫扩增产物；3：阴性对照

2.1.3 混合感染情况经马泰勒虫和驽巴贝斯虫诊断DNA 片段扩增，发现两种梨形虫共同感染的血液样品有7个，感染率为10.3%。

2.1.4 马梨形虫感染情况分析马驽巴贝斯虫及泰勒虫PCR 总感染率分别为58.8%(40/68)和14.7%(10/68)，两乡均以驽巴贝斯虫感染为主，A乡、B 乡共68 匹焉耆马中分别有不同的混合感染情况，感染率分别为14.0%(6/43)和4.0%(1/25)，经SPPS20.0 软件分析，两地区梨形虫血涂片及PCR感染情况无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 和静县部分地区散养户焉耆马梨形虫PCR检测结果

2.2 不同性别马匹感染马梨形虫病检查结果对不同性别放牧马群进行马梨形虫病流行病学调查分析。PCR 结果表明，马匹普遍感染驽巴贝斯虫，且驽巴贝斯虫感染率高于马泰勒虫；公马与母马驽巴贝斯虫感染率分别为57.9%和60.0%，感染率最低为;公马梨形虫感染率均高于母马；不同性别马匹梨形虫血涂片及PCR 结果。经SPPS20.0 软件分析，公马与母马梨形虫检出率均无显著差异(P>0.05)，见表2。

表2 不同性别焉耆马梨形虫病感染情况

2.3 不同年龄马匹感染马梨形虫病检查结果

对不同年龄放牧马群进行马梨形虫病流行病学调查分析，各年龄段马匹梨形虫均有感染；不同年龄马匹梨形虫血涂片及PCR 结果经SPPS20.0软件分析，各年龄段感染马梨形虫情况无显著差异(P>0.05)，见表3。

表3 不同年龄段焉耆马梨形虫病感染情况

3 讨论与小结

调查结果表明，巴州和静县是马梨形虫病的流行地区，此次试验通过随机抽样被检样品对马梨形虫病采用血液涂片染色镜检法和聚合酶联式反应(PCR)检测。传统方法是血涂片法，该方法检测的准确性较差，而且带虫状态感染的隐性马匹，在多数情况下很难发现虫体，只有在高热期时虫体检出率较高。PCR技术是诊断该病较好的方法，本试验通过对68 份血液样本的PCR 检测，马泰勒虫阳性样品为10 份，其感染率为14.71%(10/68)；驽巴贝斯虫阳性样品为40 份，其感染率为58.82%(40/68)；显著高于血液涂片染色镜检法的16.9%(35/68)。将68 头份被检血液涂片的检测结果按不同地区、年龄、性别分组分别进行比较，经统计学分析，马巴梨形虫感染情况在年龄段上和性别上均无明显区别。

经本次PCR 诊断结果分析，和静县部分地区散养户焉耆马梨形虫病病原种类主要以驽巴贝斯虫为主，以泰勒虫为辅，且亦混合感染，笔者建议，通过与科研院校合作的方式可以解决基层工作技术、设备不足等问题，通过分子生物学早期诊断，随时掌握地方马匹感染马梨形虫病病原种类及其感染强度。该试验数据可为地方散养户马梨形虫病的综合防控奠定基础。

[1] 孙响，张桂林，刘晓明，等.新疆和硕地区主要蜱类及蜱媒病原体调查[J].中国媒介生物学及控制杂志，2013(1)：5-7.

[2] 敖敦格日乐，格日勒图，朱玉涛，等.内蒙古和新疆两地草原革蜱源性马驽巴贝斯虫病病原DNA 检测[J].中国兽医杂志，2015，51(5)：21-23.

[3] 李佳，张杨，王振宝，等.马泰勒虫荧光定量PCR 检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2014，38(9)：720-722.

[4] 李佳，李永畅，王振宝，等.马泰勒虫二温式PCR 检测方法的建立及应用[J].中国动物检疫，2014，31(5)：78-80.

[5] 罗金，刘光远，谢俊仁，等.马泰勒虫病PCR 检测方法的建立和应用[J].中国畜牧兽医，2012，39(2)：28-31.

[6] 张杨，达伊力特，刘进，等.驽巴贝斯虫二温式PCR 检测方法的建立及初步应用[J].动物医学进展，2014，35(6)：16-18.

[7] 伊春阳，郭庆勇，薛红，等.血红扇头蜱和草原革蜱源性驽巴贝斯虫病原DNA 检测[J].黑龙江畜牧兽医，2014(21)：38-40.

[8] 龚真莉，刘光远.马属动物梨形虫病的PCR 鉴别诊断方法研究[J].中国动物检疫，2014，31(5)：74-77.

[9] 朱明轩.马属动物驽巴贝斯虫病的诊断与防治[J].农业科技与信息，2008(9)：51.

[10] 罗金，刘光远，田占成，等.18S rRNA 序列差异在马梨形虫分类学中的应用[J].中国兽医杂志，2012，48(10)：6-9.

[11] 刘晓明，张桂林，赵焱，等.新疆尉犁荒漠化区蜱中主要蜱传疾病病原检测[J].中国媒介生物学及控制杂志，2012(6)：496-498.

2015-08-19