仇微红 ， 彭 特 ， 胡秀美 ， 许利娜 ， 叶贺佳

(华南农大生物药品有限公司 ， 广东广州511300)



新城疫病毒F基因的序列分析及攻毒保护对比试验

仇微红 ， 彭 特 ， 胡秀美 ， 许利娜 ， 叶贺佳

(华南农大生物药品有限公司 ， 广东广州511300)

对近年来实验室分离的4株新城疫病毒，运用RT-PCR方法扩增出该病毒的F基因的ORF序列，并进行序列测定及攻毒保护试验。经序列对比、进化分析发现，NK01株、GD03株、HY04株属于基因Ⅶd亚型，F蛋白裂解位点序列为112R-R-Q-K-Q-F117，具有强毒株分子特征。对4株分离毒株与标准毒株LaSota株进行血清交叉反应及攻毒保护对比试验，结果发现NK01株、GD03株、HY04株对HY04株具有良好的保护效果，保护率分别为100%、90%、80%；CM02株、LaSota株对HY04株保护效果不理想，保护率仅为60%。

新城疫病毒 ； 基因Ⅶ型 ； 免疫效力

新城疫(NDV)是由新城疫病毒引起的一种禽急性、烈性传染性疫病，主要侵害鸡和火鸡，发病率和死亡率均很高，是危害我国养禽业的严重疾病。NDV为副黏病毒科、副黏病毒亚科、禽腮腺炎病毒属成员。其基因组为单股负链不分节段RNA，长约15.2 kb，至少编码6种蛋白，分别为NP、P、M、F、HN、和L蛋白。F蛋白(Fution protein，融合蛋白)和HN蛋白(Haemagglutinin-neuraminidase，血凝素神经氨酸酶蛋白)是病毒的主要免疫原性蛋白，可诱导机体产生中和抗体。F蛋白介导病毒与宿主细胞的膜融合，其裂解位点序列与病毒毒力有关。

目前我国主要流行基因Ⅶ型NDV，尤以Ⅶd亚型为主。本研究主要对实验室分离的几株新城疫病毒的F基因、血清交叉及攻毒保护试验进行分析，为新的ND疫苗研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 NK01株、CM02株、GD03株、HY04株为新城疫分离毒，分别按现有生产工艺制备灭活疫苗，LaSota株，购自中国兽医药品监察所，5种疫苗均由广州市华南农大生物药品有限公司制备及提供。

1.1.2 引物设计与合成 根据GenBank中发表的NDVF基因核苷酸序列，通过比对后应用Primer5.0软件设计了2对特异性引物，预计扩增片段长度分别为534 bp和1 662 bp，包括F基因完整的开放阅读框。引物序列均由广州Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离 在山东、广东、广西等养殖场鸡群，采集发病鸡内脏组织处理后，接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1 mL，37 ℃孵化，收集 24～120 h死胚及活胚的尿囊液，测定血凝价。对阳性的尿囊液进行病毒鉴定，阴性尿囊液则进行盲传3代。

1.2.2 病毒的鉴定

1.2.2.1 血清学鉴定 将有血凝活性的鸡胚尿囊液分别与新城疫病毒、减蛋综合征病毒、H5亚型禽流感病毒的标准阳性血清进行血凝抑制(HI)试验。

1.2.2.2 病毒的RT-PCR鉴定与F基因序列分析

取收获后的8份鸡胚尿囊液进行PCR扩增，对经鉴定为NDV阳性的4个病毒的F基因ORF进行扩增、TA克隆。将鉴定为阳性的重组质粒送Invitrogen公司测序。利用DNAStar和MEGA6.0等软件在F基因核苷酸水平上绘制系统进化树进行分析。

1.2.3 血清交叉试验 将50只21日龄SPF鸡随机分成A、B、C、D、E共5组，10只/组，各组分别经颈部皮下注射鸡新城疫灭活疫苗(NK01株)、鸡新城疫灭活疫苗(CM02株)、鸡新城疫灭活疫苗(GD03株)、鸡新城疫灭活疫苗(HY04株)、鸡新城疫灭活疫苗(LaSota株)0.25mL/只。另设5只同日龄SPF鸡不免疫作空白，对照。免疫后21日各组分别采血分离血清，使用相对应血凝抑制抗原测定血清的HI抗体效价。

1.2.4 攻毒保护试验 免疫后21日，将试验鸡逐一编号连同对照鸡5只，分别使用新城疫基因Ⅶ病毒HY04株进行攻毒，腿部肌肉注射0.5 mL/只(含100LD50)，攻毒后每日观察试验鸡的发病或死亡情况，并及时记录，持续14 d，并于攻毒后5 d采集试验鸡的泄殖腔及喉拭子进行病毒分离。

2 结果

2.1 病毒的分离与鉴定结果 8份病料接种SPF鸡胚后，分到4株病毒，分别命名为NK01株、CM02株、GD03株、HY04株。按照微量法进行HA和HI试验，结果显示，所收获的尿囊液具有血凝活性，且能够被NDV标准阳性血清完全抑制，而不能被H5、H7、H9、EDS等阳性血清抑制。

用NDV特异性引物对8份病料接种的SPF鸡胚尿囊液进行RT-PCR检测，其中4份扩增得到与目的大小相符的片段(534bp)，表明分离得到4株NDV(图1)。

图1 F基因特异性引物RT-PCR检测电泳图

M：DL-2 000 DNA Marker；1：NDV阳性对照；2：NDV阴性对照；3～10：分别为病料传代后收获尿囊液，其中3～6分别为分离毒NK01株、CM02株、GD03株、HY04株，7～10为分离毒阴性

2.2 F基因系统进化树分析 由图2新城疫F基因绘制的系统进化树分析显示，CM02株属于基因Ⅱ型，NK01株、GD03株、HY04株均属于基因Ⅶd型。

2.3 血清交叉试验结果 试验结果表明，A组使用NK01抗原检测抗体相对较高，达到9.0 log2，与其他4种抗原检测相差1～2 log2，差异较显著；B、C、E组血清抗体效价均为7log2左右，各种抗原间差异不显著；D组抗体水平则在6 log2左右，各种抗原间差异不显著。结果见表1。

2.4 攻毒保护试验结果 由表3结果可知，A组试验鸡使用HY04株进行攻毒，攻毒后免疫鸡均全部存活，采集试验鸡的泄殖腔拭子进行病毒分离，均为阴性，NKO1株疫苗对该毒株的攻毒保护率为

图2 NDV F基因的系统进化树分析

注：NK01株、CM02株、GD03株、HY04株为分离毒，LaSota株为基因Ⅱ型标准毒

表1 疫苗免疫后21 d血清交叉情况 (单位：log2)

*：差异显著

100%(10/10)；B组试验鸡使用HY04株进行攻毒，试验鸡40%(4/10)病毒分离阳性，CM02株疫苗对该毒株的攻毒保护率为60%(6/10)；C组试验鸡使用HY04株进行攻毒，试验鸡10%(1/10)病毒分离阳性，GD03株疫苗对该毒株的攻毒保护率为90%(9/10)；D组试验鸡使用HY04株进行攻毒，试验鸡20%(2/10)病毒分离阳性，HY04株疫苗对该毒株的攻毒保护率为80%(8/10)；E组试验鸡使用HY04株进行攻毒，试验鸡40%(4/10)病毒分离阳性，LaSota株疫苗对该毒株的攻毒保护率为60%(6/10)；对照鸡使用HY04株进行攻毒，均于4d内100%(5/5)全部死亡。

3 讨论

3.1 新城疫病毒强弱毒株的判定标准一般依据ICPI和F蛋白裂解位点序列进行判定[3]。NDV中强毒株和强毒株裂解位点附近氨基酸序列多为112R/K-R-Q/K-K/R-R-F117，而弱毒株则多为112G/EK/R-Q-G/E-R-L117[4]。本次分离的NK01株、GD03株、HY04株基因Ⅶd亚型毒株F蛋白裂解位点序列为112R-R-Q-K-Q-F117，符合强毒株裂解位点的特征。CM02株基因Ⅱ型毒株F蛋白裂解位点序列为112G-R-Q-G-R-L117，符合弱毒株裂解位点的特征。

表2 攻毒保护情况

3.2 据报道，1948-2009年间，在488株NDV毒株中，依据其F基因分型的方法，其中：基因Ⅰ型为13株，Ⅱ型为72株，Ⅸ型为27株(有人称Ⅲ型)，Ⅵ型为41株，Ⅶ型为335株，占我国流行毒株的大多数，占68.6%。值得关注的是：基因Ⅶ型又根据其进化差异分为不同的亚型：为a～e亚型，我国广泛流行基因Ⅶd[5]，结合本次试验结果，证实了这一点。

3.3 血清交叉试验结果表明，不同基因型的抗原检测相同的血清存在一定的差异，与其他研究结果相符。尽管多年来认为NDV只有一个血清型，但不同毒株间存在抗原差异的事实也已为许多学者证实。结合本次攻毒保护试验及血清交叉结果，由于抗原性存在一定的差异，针对新城疫基因Ⅶ强毒株的攻击，基因Ⅶ型NK01株的疫苗具有良好的保护效果，保护率为100%，基因Ⅱ型CM02株、LaSota株的疫苗攻毒保护效果不理想。

3.4 梁荣等在CEF细胞上进行的中和试验同样证明分离自西北地区的NDV毒株与现行的LaSota株系疫苗株和我国攻毒标准株F48E9之间存在较大的抗原性差别，这种差别很可能是造成La-Sota株系疫苗免疫失败的原因之一[6]。由于基因Ⅶ型的出现使得我国ND的流行情况更加复杂，而强毒株不能用于疫苗候选毒株，因此，利用反向遗传技术拯救病毒，并培育新城疫基因Ⅶ型弱毒疫苗株对新城疫的综合防控具有重要的意义。

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[6] 梁荣，曹殿军，陈杰，等.中国西北地区新城疫病毒分离株基因型与抗原性的关系[J].中国兽医科技，2011，31(7)：5-8.

2016-03-11

仇微红(1982-)女，兽医师，硕士，主要从事生物制品的研究及病毒生物学特性研究，E-mail：qiuweihong@gzscbm.com

彭特(1987-)，女，硕士，主要从事生物制品及病毒生物学特性研究，E-mail：pengte@gzscbm.com

叶贺佳，E-mail：yehejia@gzscbm.com

S858.31

A

0529-6005(2016)10-0009-03

注：彭特与仇微红对本文具有同等贡献