皇甫和平 ， 许文博 ， 石冬梅

(河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南郑州450046)



奶牛蜂窝织炎奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏试验

皇甫和平 ， 许文博 ， 石冬梅

(河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南郑州450046)

从奶牛蜂窝织炎病变组织中分离出1株细菌，通过菌落形态观察、染色镜检，以及16S rRNA 基因的PCR 扩增和序列分析，证实分离到的细菌为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis，PM)。药敏试验结果显示，该菌株对庆大霉素、左氧氟沙星、氨苄西林、阿米卡星、氯霉素和磺胺甲氧嘧啶敏感，但同时也产生了一定的耐药性，对头孢曲松、头孢噻肟和四环素耐药。提醒今后在奶牛外科感染的治疗中，应注意耐药性问题。

奶牛 ； 蜂窝织炎 ； 奇异变形杆菌 ； 分离鉴定 ； 药敏试验

蜂窝织炎是机体疏松结缔组织内发生的一种急性弥漫性化脓性感染，属于一种严重的外科感染。引起蜂窝织炎的病原菌种类很多，常见的有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌和大肠杆菌等。

奇异变形杆菌(Proteusmirabilis，PM)是一种条件致病菌，属于肠杆菌科变形杆菌属，能引起人、禽、羊和猪等多种动物感染。近几年国内变形杆菌引起奶牛感染的病例陆续增多，其可引起子宫内膜炎、乳腺炎、关节炎和呼吸道感染等[1-4]。但奶牛蜂窝织炎中奇异变形杆菌的分离未见报道。笔者在2014 年的奶牛疾病临床诊疗中，见1例典型的蜂窝织炎病例。病牛腹壁皮下发生大范围蜂窝织炎，病牛表现精神沉郁，食欲不振，体温升高，卧地不愿行走，肿胀由乳腺前部的腹壁皮下至胸壁部皮下，剖检在相应部位可见大量化脓肉芽组织。本实验室从蜂窝织炎病料中分离出1 株细菌，通过形态观察、显微镜镜检、16SrRNA 基因的PCR 扩增及序列分析，鉴定为奇异变形杆菌。随后利用11 种药物对分离菌株进行了敏感性试验。

1 材料

1.1 主要试剂TaqPCR Master Mix、DNA Mark.er、4S Green 核酸染料、SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；药敏纸片由英国OXOID 公司生产；营养琼脂、营养肉汤，购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器 ETC-811 PCR 仪由北京东胜创新生物科技有限公司生产；Universal Hood II 凝胶成像系统由美国伯乐(BIO-RAD)公司生产；HR40-IIB2 生物安全柜由青岛海尔特种电器有限公司生产；3-30K 高速冷冻离心机由德国Sigma 公司生产；900 系列超低温冰箱由美国赛默飞世尔科技有限公司生产。1.3 病料及参考菌株 病变肉芽组织由河南牧业经济学院临床兽医实验室收集。参考菌株信息见表1。

1.4 引物 根据Weisburg[12]介绍的方法合成16SrRNA基因引物，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：16S-F(5′-CCG AATTCG TCG ACA ACA GAG TTT GAT CAT GGC TCAG-3′)、16S-R(5′-CCC GGG ATC CAA GCT TACGGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)。

2 方法

2.1 细菌分离培养 无菌方法采集化脓性肉芽组织，直接划线接种于营养琼脂培养基中，37 ℃培养24 h，观察菌落生长情况。再挑取直径1～3mm 的单克隆菌落划线接种于营养琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，进行纯化。再次挑取单克隆菌落进行革兰染色镜检观察菌体形态，同时接种营养肉汤，37 ℃ 180 r/min震荡培养18 h，4 ℃存放备用。

2.2 菌体DNA制备 水煮法：取1 000 μL菌液于1.5 mL 离心管中，10 000 r/min 离心5 min，弃去上清液，加入600 μL TE 缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 值8.0)重悬沉淀，100 ℃沸水浴10 min，立即冰浴2 min，1 2 000 r/min 离心10 min，上清液即为DNA 溶液，立即使用或-20 ℃备用。

2.3 PCR 反应 反应体系(50 μL)：Tap PCR Mas.ter Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，16S-F 2 μL，16S-R 2μL，模板DNA 1 μL。反应条件：95 ℃预变性5min；95 ℃预变性45 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸2min，30 个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR 产物用1%琼脂糖凝胶在1×TAE 电泳液中电泳，用4SGreen Nucle Acid 染色，在凝胶成像系统中观察PCR结果。

2.4 DNA 测序及序列分析 PCR 产物电泳检测后，直接提交上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将序列进行BLAST 比对。以多杀性巴氏杆菌Kobe6 为外群，将分离株和表1 中其他变形杆菌的16S rRNA 基因序列，利用DNAStar 软件中的MegAlign 计算种间相似性(Jotun hein 法)。最后利用phylip3.67 进行系统发育分析，使用1 000个重复。

表1 菌株序列信息

-：信息不详

2.5 药敏试验 选取11种药敏纸片，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)抗菌药物敏感性试验标准(M100-S23)，对分离到的细菌进行药敏试验。测量抑菌圈后，根据抑菌圈的大小判定细菌对药物的耐药与敏感情况。

3 结果

3.1 细菌分离培养结果 经过24 h 培养，在普通琼脂平板上形成中等大小、圆形微凸起、表面光滑湿润、灰白色的菌落。在普通肉汤培养基中培养18 h 后，呈均匀浑浊，管底可见絮状沉淀物。细菌涂片染色镜检，可见两端钝圆，有的近似球杆状，多数散在排列的革兰阴性短杆菌。

3.2 16S rRNA 基因PCR结果 以分离株基因组DNA 为模板，进行16S rRNA 基因的PCR 扩增，获得约1 400 bp的电泳条带(图1)，与预期扩增片段大小相符。分离株的序列已经提交GenBank，收录号为KP973965。

图1 16S rRNA基因PCR产物检测

B：空白对照； 1：分离菌株； P：阳性对照； M：DL-2 000 DNA Marker

3.3 测序结果分析 分离菌株16S rRNA 基因序列的BLAST 比对结果显示，与分离株亲缘关系最近的3 株参考菌株均为奇异变形杆菌，相似性为100%。基于16S rRNA 基因序列构建的系统发育树(图2)显示，分离株与奇异变形杆菌亲缘关系最近，明显位于同一分支中；与奇异变形杆菌关系最近的为彭氏变形杆菌(Proteuspenneri)，位于同一分支内，而豪氏变形杆菌(Proteushauseri)和普通变形杆菌(Proteusvulgaris)则位于更高一级的分支；基于16S rRNA 基因序列进行的同源性分析结果见图3，由表2 可知，分离菌株与奇异变形杆菌参考株的相似性介于99.4%～100%，彭氏杆菌参考株与奇异变形杆菌的相似性为98.8%～99.3%，分离株与另外两种变形杆菌的相似性分别为98.5%和98.6%。

图2 16S rRNA 基因遗传进化树

图3 基于16S rDNA序列的同源性关系

3.4 药敏试验结果 药敏试验结果见表2，结果显示分离菌株对庆大霉素、左氧氟沙星、氨苄西林、阿米卡星、氯霉素和磺胺甲氧嘧啶敏感；对头孢曲松、头孢噻肟和四环素耐药；对妥布霉素和环丙沙星中度敏感。

表2 药敏试验结果

S：敏感； I：中介； R：耐药

4 小结与讨论

根据细菌分离培养结果、显微镜镜检特征，以及16S rRNA 基因序列比对结果，初步证实分离到的细菌为奇异变形杆菌，命名为PMYU3。基于16S rRNA 基因的序列分析结果显示，分离菌株与奇异变形杆菌参考株的相似性介于99.4%～100%，符合判定标准，即细菌的16S rRNA基因序列相似性大于99%时，判定为一个种[13]；同时，进化树结果表明，分离株与所有奇异变形杆菌参考株位于一个分支。因此可以判定分离菌株属于奇异变形杆菌。这是国内首例在奶牛蜂窝织炎中分离出奇异变形杆菌的报道，应引起临床兽医工作者的重视。

因为rRNA 基因保守性极强，进化缓慢，其被认为是细菌的“活化石”，通过该基因的序列分析来对细菌进行分类和鉴定也已得到公众的认可。相较于传统的细菌鉴定方法，16S rRNA 基因的序列分析简单快速，更适合于普通兽医实验室对临床分离菌株的快速鉴定，尤其是细菌16SrRNA 通用型PCR 引物的使用[6]，极大方便了该基因的体外扩增，值得在普通兽医实验室推广应用。

耐药性试验结果表明，分离的奇异变形杆菌对11 种药物的3 种产生了耐药性，这也解释了奶牛临床中有些外科感染病例不易控制的原因，提醒兽医工作者今后应更加重视外科感染病原菌耐药性的问题，加强兽医外科感染致病菌种类的调查和耐药性问题的研究。

在当代规模化饲养模式下，奶牛发生外科感染的几率更大。规模化牧场中引起奶牛外科感染的主要病因如下：频繁的防疫注射，针头消毒不严引起感染；饲养管理中的外伤：刮粪板、卧床挡板、固定前挡板的螺丝等对皮肤的损伤；粪道污秽不洁等引起蹄部的感染。因此，蜂窝织炎等外科感染的预防，首先要加强牛舍卫生管理，保持牛体、卧床等的卫生干燥；其次，严格注射时的无菌操作；再次，对于老化的刮粪板、钢丝绳要及时更换；最后，对于手术后的病牛要加强护理。

相较于其他普通外科感染，蜂窝织炎感染发展迅速、范围广泛，具有明显的全身症状。因此，针对该病，在局部治疗的同时，应注重全身治疗，选用敏感的抗菌药物，严重的病牛静脉输液增强体质及对症治疗。

[1] 王国卿，王洪海，郭梦尧，等.奶牛产后急性子宫内膜炎病原的分离与鉴定[J].中国兽医杂志，2010，46(10)：10-12.

[2] 冯超.呼和浩特地区某奶牛场奶牛乳腺炎病原菌的分离鉴定和药敏试验[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2013.

[3] 王旭荣，常瑞祥，王国庆，等.一株与奶牛关节脓肿相关的致病性奇异变形杆菌的分离与鉴定[J].动物医学进展，2013，34(9)：118-121.

[4] 李韦伟，田东升，江红，等.肉用犊牛呼吸道病原菌的分离鉴定[J].畜牧兽医杂志，2014，33(4)：4-8.

[5] Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，etal. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J] . J Bacteriol，1991，173(2)：697-703.

[6] Drancourt M，Bollet C，Carlioz A，etal.16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical uniden.tifiable bacterial isolates[J].J Clin Microbiol，2000，38(10)：3623-3630.

2015-03-23

河南省教育厅科技攻关计划项目(13B230335)；河南牧业经济学院博士科研启动资金项目(5040610)；河南牧业经济学院第五批学术带头人培养项目

皇甫和平(1977-)，男，讲师，博士，主要从事动物疾病发病机理研究，E-mail：hepinghf@163.com

石冬梅，E-mail：dongmeishi126@126.com

S858.23

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0529-6005(2016)10-0032-03