李 玥 ， 王冠颖 ， 李欣然 ， 姜仁礼 ， 范晓静 ， 刘 旭 ， 王晶璐 ， 高 利

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江哈尔滨150030)



马骨关节炎模型关节液中COMP含量变化的研究

李 玥 ， 王冠颖 ， 李欣然 ， 姜仁礼 ， 范晓静 ， 刘 旭 ， 王晶璐 ， 高 利

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江哈尔滨150030)

为探索马骨关节炎病变程度与关节液中软骨代谢标志物软骨寡聚基质蛋白(COMP)水平的关系，试验选用13匹蒙古马，随机分为试验组(n=8)和对照组(n=5)试验组左侧腕关节内注入2 mL两性霉素B(25 mg/mL体重)，建立马骨关节炎模型；对照组左侧腕关节注射2 mL 生理盐，水。每周采集关节液1次，用ELISA法检测马关节液中COMP的含量。结果显示，试验组关节液COMP浓度在注射两性霉素B后第14天开始显著升高(15.54 μg/L±1.46 μg/L)，与对照组(11.29 μg/L±0.73 μg/L)比较差异极显著(P<0.01)；试验组COMP浓度保持增高的趋势直至第63天试验结束；第21天试验组马匹开始出现不同程度跛行。试验结果表明，关节液内COMP浓度升高比马跛行出现得早，推测COMP可以作为马骨关节炎(OA)早期诊断的生物标记物。

骨关节炎 ； 两性霉素B ； COMP

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一类以软骨退化、软骨下骨硬化和边缘骨赘形成为主要病理变化的疾病。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬，关节肿胀、活动受限以及关节畸形等。在表现出临床症状时可以通过X线检查及关节镜对骨关节炎进行确诊，但是通常在X 线检查出现异常前就已出现软骨损伤、关节狭窄、关节畸形等软骨的病变[1]。探索血清、关节液或尿液中软骨代谢物浓度与软骨病变程度间关系，有助于判断骨关节炎软骨病变的程度、预后和治疗效果，是骨关节炎早期诊断有效的辅助方法。软骨寡聚基质蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein，COMP)是软骨非胶原蛋白重要成分，主要分布在软骨、滑膜和肌腱[2]。目前国内关于马骨关节炎生物标记物的研究未见相关报道。本研究采用夹心酶联免疫吸附法(Sandwich-ELISA)测定关节液内COMP 水平，探索马骨关节炎病变程度与关节液中软骨代谢物COMP 水平的关系，为马骨关节炎的早期诊断提供理论依据及参考标准。

1 材料与方法

1.1 试验动物 试验动物为13 匹蒙古马，平均体重420 kg(313～487 kg)，平均年龄7 岁(5～8 岁)，购自肇东市某养殖场。对每匹马进行体况评分[3]，得分均在4～6分之间，无肢蹄病史且临床检查没有肢蹄病。将13匹马随机分为对照组(n=5)和试验组(n=8)。试验前，将马在试验场地饲喂两个星期以适应环境。

1.2 造模 造模前，对所有试验马匹进行体况检查和跛行评估。跛行评估标准参照美国马兽医协会(AAEP)制定的跛行分级标准[4](见表1)。体况检查合格，临床检查未见跛行后静脉注射盐酸地托咪定(10 μg/kg体重)和盐酸美沙酮(0.1 mg/kg体重)，进行镇静。试验组在马左侧腕关节内注入 2 mL 两性霉素B(25 g/mL)，建立马骨关节炎模型[5]，对照组在马左侧腕关节注射2ml生理盐水。

1.3 样本处理及数据处理 试验组和对照组的马每7天采集一次关节液，直至第63天。采样前先进行体况检查和跛行评估，而后静脉注射盐酸地托咪定(10 μg/kg体重)和盐酸美沙酮(0.1 mg/kg体重)进行镇静。对腕关节皮肤消毒，用注射器抽取液 1 mL，采样后将样本13 000 r/min离心10 min取上清液，使用COMP酶联免疫检测试剂盒检测样本中COMP浓度。

表1 马的跛行分级

数据处理用Social Sciences 18.0(SPSS Inc.，USA)软件，每个时间点采用单因素方差LSD(L)分析法分析。结果表示为MEAN±SD。

2 结果

2.1 临床症状 试验期间，对照组马匹均未出现跛行；试验组在腕关节注入两性霉素B后第21天陆续出现跛行，而后逐渐加重，第63天出现4级跛行。

2.2 关节液COMP浓度变化 试验组关节液COMP浓度在注射两性霉素B后第14天开始显著升高，与对照组比较差异极显著(P<0.01)；试验组COMP浓度保持增高的趋势直至试验结束(如图1，表2所示)。

图1 马关节液COMP浓度变化

3 讨论

关节软骨是由丰富的细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)和嵌于其中的少量软骨细胞所组成。ECM包括胶原成分和非胶原成分。越来越多的证据表明，在细胞-基质和基质-基质的相互作用中，非胶原蛋白成分起着非常重要的作用。COMP是一种细胞外糖蛋白，属于血小板反应素家族，是软骨非胶原蛋白的主要成分[6]。在对转基因小鼠进行的试验中发现，COMP mRNA表达上调与COMP蛋白重新分布是OA早期阶段关节软骨的特征性改变[7]。Huebner等[8]研究发现，有OA倾向的荷兰猪的关节液中COMP浓度变化比软骨组织损伤造成的组织学改变要早两个月左右。Saxne等[13]在研究中发现，原发性骨关节炎及临床有关节疼痛但无影像学改变的患者，其关节液中COMP水平较对照组(正常人组)高。目前，COMP的生物学意义仍然不是很清楚，但是可以肯定的是COMP通过与胶原纤维和软骨基质的相互作用，参与到稳定ECM的过程中，从而起到结构性功能作用[9]。因此，COMP与关节损伤之间的联系已越来越受到重视。

表2 马关节液COMP浓度(μg/L)变化

*：差异显著(P<0.05)，**：差异极显著(P<0.01)

在本试验中，将两性霉素B注入左侧腕关节建立马骨关节炎模型，相比手术方法建立的骨关节炎模型，用两性霉素B建立骨关节炎模型具有快速、简便、安全等优点，同时又避免了手术创口对试验的影响[10]。有研究发现，关节内注射两性霉素B建立驴OA模型引起的关节病变[5]与手术法建立鼠OA模型引起的关节病变相似[11]。在整个试验过程中，对照组关节液内COMP浓度无明显变化；试验组关节液COMP浓度在注射两性霉素B后第14天开始显著增加(P<0.05)在整个试验过程中关节液COMP浓度持续升高直，至第63天试验结束，这一结果与人OA病变过程中COMP变化趋势相符[12]；试验组在腕关节注入两性霉素B后第21天开始出现不同程度跛行。关节内注射两性霉素B建立OA模型引起试验马匹跛行可能是由于两性霉素B对软骨基质和滑膜的毒性作用引起炎症反应以及滑液分泌增多导致的。

本试验结果证明，软骨损伤发生在OA临床症状出现之前，并且COMP分泌增加。这一试验结果提示关节液中的COMP可以作为马OA的潜在的生物标记物，为马骨关节炎快速诊断提供试验基础。

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Changes in synovial fluid COMP from equine with experimentally-induced osteoarthritis

LI Yue ， WANG Guan-ying ， LI Xin-ran ， JIANG Ren-li ， FAN Xiao-jing ， LIU Xu ， WANG Jing-lu ， GAO Li

(College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the relationship of lesion extent of osteoarthritis to COMP level，the marker of cartilage metabolites，in synovial fluid，13 horses were divided into experimental(n=8)and control groups(n=5)，Acute osteoarthritis was induced in 8 horses by a sterile intra-articular injection of 2 mL Amphotericin-B(25 mg/mL)into the left carpal joint，and the control group was injected into the left carpal joint with 2ml Saline.Synovial fluid was collected once a week，and the concentrations of COMP were measured with ELISA kit.Compared with the control group(11.29μg/L±0.73μg/L)，the level of COMP in synovial fluid was significantly increased in the experimental group at the 14th day(15.54μg/L±1.46μg/L)，and lameness appeared at the 21th day.The results demonstrated that the level of COMP in synovial fluid increased earlier than the lameness appearance，and the COMP could be used as a biomarker for early diagnosis of equine osteoarthritis.

osteoarthritis ； Amphotericin-B ； COMP

GAO Li

2015-04-27

国家科技支撑计划资助(2012BAD46B02-03)

李玥(1990-)，女，博士生，研究方向为马肢蹄病的研究，E-mail：liyue_315207218@163.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com

S821.8+1；S857.16+5

A

0529-6005(2016)10-0012-03