李世平， 董 梅， 郭彦芳， 程树彬， 张祥建， 李春岩



NBP对器官型脑片糖氧剥夺模型中细胞凋亡的影响

李世平， 董 梅， 郭彦芳， 程树彬， 张祥建， 李春岩

目的 观察正丁基苯酞(NBP)对乳大鼠大脑皮质器官型脑片的氧糖剥夺模型(OGD)中细胞凋亡和线粒体电位的影响。方法 建立SD乳鼠大脑皮质运动区的器官型脑片，SMI-32染色观察锥体细胞。2 w后，随机分为对照组(C组)和实验组(T组)，T组在OGD干预30 min后给予不同剂量NBP，分为T0、T0.01、T0.1、T1、T10组，给NBP前和后1 h观察PI染色；选择T0组、T10组，观察两组在OGD 30 min、NBP 1 h、24 h、72 h、7 d等不同时间点PI染色变化。于NBP后1 h各T组进行JC-1线粒体膜电位检测。结果 器官型脑片OGD 30 min给予NBP 1 h后，C组和各T组PI染色可见不同亮度红色荧光，各T组荧光强度均大于C组，荧光强度与NBP浓度(0～10 μmol/L范围内)呈负相关，各T之间组及与C组相比差异有显著性(P<0.05)；T0组和T10组在OGD 30 min均出现明显细胞凋亡，两组无显著性差异。复氧复糖后随时间延长T0组细胞凋亡增加，T10组逐渐减少，差异显著(P<0.05)；C组和各T组JC-1线粒体检测试剂盒染色可见OGD 30 min，复氧复糖1 h后，红色荧光/绿色荧光(R/G)的值明显减小，R/G的值与NBP浓度呈正相关，各T组R/G值均小于C组，差异显著(P<0.05)。结论 OGD模型可模拟缺血性脑损伤的病理变化，重复性良好；NBP对缺血性脑损伤导致的急性和迟发性细胞凋亡均具有保护作用；NBP对脑片损伤后线粒体电位的耗散有阻止作用，且与剂量相关。

器官型脑片； OGD； 正丁基苯酞； 细胞凋亡； PI染色

缺血性脑卒中的致死致残作用严重威胁着患者的生活质量。神经元的缺血损伤和凋亡与患者神经功能恢复关系密切，挽救神经元损伤和凋亡对改善患者预后至关重要。

器官型脑片氧糖剥夺模型(oxygen and glucose deprivation，OGD)保存了与在体组织非常接近的细胞构成和各种生理功能，培养条件和干预方式可准确控制和便于操作[1]，避免了血脑屏障和动物模型侧枝循环的个体差异等因素影响，且一些性状指标可在活体状态下连续观察，因此应用逐渐增多[2]。

正丁基苯酞(n-butyl phthalide，NBP)是芹菜甲素的人工合成消旋体，研究表明其具有改善脑缺血后能量代谢、保护线粒体、缩小梗死面积、改善脑缺血后神经功能[3～5]等。本研究旨在建立乳鼠大脑皮质体外培养的OGD模型，应用SMI染色、PI染色和JC-1染色等方法，观察NBP对OGD诱发的脑片急性损伤和迟发性细胞凋亡的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和器材 实验动物为出生后5～7 d的SD乳鼠(河北医科大学动物中心提供)，雌雄不限。实验试剂包括正常培养液：50%MEM+25%马血清+25%Hank’s平衡液(三种均购自Gibco公司)+葡萄糖，无糖培养液同上述成分不加葡萄糖，Geys平衡盐溶液，DMSO，Propidium iodide(Sigma)，单克隆小鼠抗非磷酸化神经丝单克隆抗体(SMI-32，Stemberger Monoclonals)，线粒体膜电位检测试剂盒JC-1(碧云天生物技术研究所，C2006)，正丁基苯酞原料药(NBP，石药集团恩必普药业有限公司免费提供)等。实验器材包括CO2培养箱(Sanyo，MCO-18AIC)，Mcilwain活组织切片机，插入式培养皿Millicell-CM insert(Millipore)，厌氧罐，空气真空泵(天津奥特塞恩斯仪器有限公司，AP-01D)，倒置荧光显微镜(Olympus)等。

1.2 大脑皮质器官型脑片的制备及SMI-32染色 根据参考文献[6，7]，选用5～7 日龄SD乳鼠，快速剥离脑组织后留取顶叶皮质并修整组织块，用组织切片机连续切成350 μm厚冠状切片，放置在insert培养皿内，于37 ℃ CO2培养箱孵育，箱内持续通入5%CO2和95%空气的混合气体，每周换液两次。分别在培养1 w、2 w、3 w、4 w时，对脑片进行SMI-32染色，观察锥体细胞生长并计数。

1.3 脑片OGD建立及NBP干预 取培养2 w脑片，随机分为对照组(C组)和实验组(T组，分为T0、T0.01、T0.1、T1、T10组)，每组9片。各T组更换无糖培养液(含PI 1 μg/ml)，置于密闭厌氧培养罐中，用真空泵抽出罐内空气，充入5%CO2+95%氮气混合气体，制备脑片OGD模型，于培养箱孵育30 min后取出，添加不同剂量NBP(0、0.01、0.1、1.0、10 μmol/L)，正常条件孵育1 h。C组同时更换两次正常培养液(含PI 1 μg/ml)，正常条件孵育。NBP为油状液体，提前以二甲基亚砜(DMSO)溶解稀释。

1.4 脑片PI染色 使用时将PI染料加入培养液稀释为1 μg/ml终浓度，孵育C组和各T组脑片20 min，在倒置荧光显微镜下观察并拍照，然后使用Image-Pro Plus 1.7软件处理，计算照片荧光强度值。因脑片厚度不同可能导致背景荧光差异，需对荧光值进行矫正。设定测得值为Gm，那么最终的值G=G/G0·G0cont-G cont，其中G0是实验脑片OGD之前所测值，G0cont是对照组在OGD之前所测得的平均值，G cont是对照组在处理的各个时间点所测得的平均值[8]。

1.5 JC-1线粒体检测试剂盒染色 配置染色工作液：取适量JC-1(200X)，按照每50 μl JC-1加入8 ml超纯水的比例稀释JC-1，充分溶解混匀，再加入2 ml JC-1缓冲液(5X)，混匀即可。吸除insert培养皿中旧培养液，加入1 ml预温至37 ℃新培养液。加入1 ml JC-1染色工作液，充分混匀，放入培养箱37 ℃孵育20 min。孵育期间，将适量JC-1染色缓冲液(5X)稀释为JC-1染色缓冲液(1X)，并放至冰浴。脑片孵育结束后，用JC-1染色缓冲液洗涤，加入1 ml培养液，分别在倒置荧光显微镜红色荧光和绿色荧光设置下观察、拍照，并使用Image-Pro Plus 5.1软件处理图片，计算红绿荧光强度比值。阳性对照的设置：采用试剂盒中提供的CCCP(10 μmol/L)按照1∶1000比例加入培养液，孵育脑片20 min，后按照上述方法加入JC-1，并在倒置荧光显微镜下观察。

2 结 果

2.1 器官型脑片锥体细胞SMI-32免疫组化染色计数 脑片在体外培养存活良好，镜下观察可见脑片体积逐渐增大，变薄，透光度增加，皮质和皮质下结构分界清晰，培养4 w时仍健康存活。培养1 w、2 w、3 w、4 w脑片进行SMI-32免疫组化染色，可见一层SMI-32阳性的细胞排列整齐，与皮质表面平行，每个细胞胞体呈椭圆形或锥形，每个细胞有一个长的顶树突伸向皮质。随着培养时间延长，细胞排列结构层逐渐清晰，数目并无明显改变(见表1、图1)。

表1 脑片锥体细胞在不同培育时间点数量

各时间点锥体细胞数无统计学差异 (P>0.05)

图1 A、B、C、D分别为1 w、2 w、3 w、4 w不同时间点SMI-32阳性锥体细胞

图2 OGD后不同浓度NBP干预，PI染色(A：对照组；B：OGD 30 min；C：NBP 0.01 μmol/L；D：NBP 0.1 μmol/L；E：NBP 1 μmol/L；F：NBP10 μmol/L)

图3 T0组荧光随时间延长亮度增加(A：对照组；B：OGD 30 min；C：T0 1 h；D：T0 24 h；E：T0 72 h；F：T0 7 d)

图4 T10组荧光随时间延长亮度降低(A：对照组；B：OGD 30 min；C：T10 1 h；D：T10 24 h；E：T10 72 h；F：T10 7 d)

图5 脑片OGD 30 min后，恢复正常氧糖含量并分别给予不同浓度NBP的PI染色值P<0.05

图6 脑片OGD 30 min后，恢复正常氧糖含量，观察T0、T10不同时间的PI染色值，T0染色值随时间递增，T10染色值随时间递减，P<0.05)

图7 器官型脑片OGD 30 min后，加入不同浓度NBP，复氧复糖1 h后，进行JC-1线粒体检测试剂盒染色，可见T组R/G值小于C组，各T组比值有差异(P<0.05)

2.2 培养脑片OGD模型及药物干预的PI染色

2.2.1 各T组PI染色 制备器官型脑片OGD 30 min后，恢复正常氧糖含量并分别给予不同浓度NBP 1 h，与C组相比，各T组均可见到不同强度的红色荧光，与NBP浓度呈负相关，各组之间差异均有统计学意义(见图2、图5)。

2.2.2 T0、T10组PI染色 器官型脑片OGD 30 min后，恢复正常氧糖含量分别加入NBP(0 μmol/L，10 μmol/L)，观察不同的时间(OGD 30 min，NBP+再灌注1 h、24 h、72 h、7 d)PI染色，可见两组在OGD 30 min后均出现了明显的细胞凋亡，差异无显著性，T0组随时间延长细胞凋亡明显增加。T10组随时间延长，PI染色逐渐减少。两组各时间点之间差异均具有统计学意义(见图3、图4、图6)。

2.3 JC-1线粒体检测试剂盒染色 器官型脑片OGD 30 min后，恢复正常条件并加入不同浓度NBP，复氧复糖1 h后，进行JC-1线粒体检测试剂盒染色，可见各T组R/G值均小于C组，各T组随NBP浓度增高，R/G值明显增高，两者呈正相关(见图7)。

3 讨 论

离体的脑片相对于在体实验和细胞实验，避免了血脑屏障、离子浓度变化、体温、pH值等个体差异的影响，保持了神经元与其他细胞的相互关系和神经突触回路等，能够有效地研究缺血性脑损伤。本实验选择了出生后5～7 d的SD乳鼠大脑运动皮质制备器官型脑片，采用Millicell膜插件的方式培养，保证营养物质和氧气的供应，成功率高，操作简便。本实验选用体外培养2 w时进行模型建立及药物干预，更接近于成年鼠的神经元对刺激损伤的变化。

本实验采用的OGD模型模拟了实际缺血过程中氧和葡萄糖的耗竭过程，使脑组织的病理改变尽可能接近在体情况下的实际变化。建立OGD模型时，本实验选用了厌氧培养罐作为密闭容器，该容器密闭性好，有单独阀门，可控制气体进出，且带有气压表，可直接观察抽出和充入气体的量，使氮气和CO2量相对稳定，体积小可直接放进培养箱孵育，最大限度维持实验过程中温度恒定，试验后可尽快恢复至正常培养条件。

NBP是我国研发的国家一类新药，对局部缺血脑组织具有改善局部血液微循环，促进局部毛细血管生长，保护线粒体等功能。林剑锋和冯亦璞在动物大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的研究中发现，MCAO术后2 h进行不同剂量NBP灌胃，能明显减少脑梗死的体积，改善神经功能，并有很好的量效关系。表明NBP对迟发型细胞损伤具有保护作用[9]。

PI是一种稳定的荧光染料，仅在细胞死亡或凋亡过程中，细胞膜遭到破坏时进入细胞，PI对神经细胞无毒性损伤，与脱氧核糖核酸(DNA)紧密结合后被激发出明亮红色荧光。本研究中PI染色表明OGD/再灌注后，发生急性细胞凋亡及迟发损伤，PI染色明显；应用NBP后PI染色随浓度的增加及应用时间的延长逐渐减弱，发生可逆性变化，提示NBP对损伤的细胞具有保护作用，可阻断细胞凋亡过程的发生。

脑缺血的细胞损伤分为急性细胞坏死和迟发的细胞凋亡。近来报道，线粒体跨膜电位耗散发生于缺血早期，不能维持线粒体内外膜之间的质子H+梯度，呼吸链受到抑制，氧化磷酸化障碍，线粒体膜的结构和通透性的改变，大量钙离子，活性氧，细胞色素C等物质释放进入胞浆，从而激活casepase家族，细胞进入不可逆的凋亡过程[10]。同时由于ATP减少，细胞能量耗竭，不能维持正常的渗透压和膜电位，蛋白质合成受到抑制，甚至基因表达异常，进一步加速了凋亡的进程[11]。稳定线粒体跨膜电位能够减少细胞凋亡的发生。这对脑梗死体积和神经功能预后有非常密切的关系，对临床治疗更有实际应用价值。

JC染色是一种以JC-1为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测。在线粒体膜电位较高时，产生红色荧光，较低时，产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以作为细胞凋亡早期的一个检测指标。本研究中JC染色结果表明脑片损伤后存在线粒体电位的耗散在早期已经出现，应用NBP干预后，可阻断线粒体膜电位的降低，且这种作用与NBP浓度存在量效关系，呈正比，表明NBP可以通过保护线粒体膜电位的作用，减轻细胞凋亡过程。

本实验观察发现，NBP对OGD/复氧复糖诱导的脑片急性和迟发损伤均具有保护作用，且有明显的量效关系。NBP(10 μmol/L)对迟发性损伤有明显的保护作用，对脑组织损伤的预后具有明显的改善作用，这一作用与NBP能够保护线粒体，减少线粒体膜电位的耗散有关，但是具体的机制有待进一步研究。

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The effection of NBP on apoptosis of organotypic brain slices in the model of oxygen-glucose deprivation

LIShipin，DONGMei，GUOYanfang，etal.

(DepartmentofNeurology，KeyLaboratoryofNeurologyofHebeiProvince，TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China)

Objective To establish the oxygen and glucose deprivation (OGD) model of organotypic brain slices of rat cerebral cortex and observe the effects of n-butyl phthalide (NBP) on apoptosis and mitochondrial membrane potential. Methods Culturing brain slices of SD rats on the membrane insert and observed the morphological changes of pyramidal cells by SMI-32 stain with immunohistochemistry. After being cultured two weeks in vitro，brain slices were divided into two groups：control group(group C) and test group(group T). Group T include five subgroup(T0、T0.01、T0.1、T1、T10) according to different concentrations of NBP(0，0.01μm，0.1 μm，1 μm，10 μm) to brain slices after treating with OGD 30 min. Brain slices were observed by PI dyeing before and after being given NBP 1 h with different concentrations. Then observing the brain slices in T0and T10dyeing by PI at different time (OGD 30min，NBP 1 h，24 h，72 h，7 d). Group C and each subgroups of T，treated by OGD and NBP in order (no PI)，were detected the mitochondrial membrane potential by JC-1 kits. Results Brain slices were treating with NBP 1 h after OGD 30 min，they showed different brightness of red fluorescence in control group and test group (T0、T0.01、T0.1、T1、T10) by PI staining. Compared with control group，the fluorescence intensity of each experimental subgroup were greater and negatively related to the concentration of NBP (P<0.05). Observing the apoptosis in slices of T0and T10at different time (OGD 30 min，NBP 1 h、24 h、72 h、7 d)，we found the number of cell death had no significant different at OGD 30 mim. After giving normal glucose and oxygen，the brain slices had increasing fluorescence intensity in T0and decreasing fluorescence intensity in T10with prolonged time (P<0.05). After OGD 30 min and returned to normal oxygen and glucose 1 h，the slices were detected by mitochondrial membrane potential detection kit(JC-1 kit). The value of red/green fluorescence of each group (C，T0、T0.01、T0.1、T1、T10) dramatic reduced correlated positively with dose of NBP. The value of each experimental group was smaller than the control group (P<0.05). Conclusion Treated with OGD，brain slices showed ischemic damage including acute cell death and delayed apoptosis. The model can be established easily. NBP had protective effect on ischemic brain. There is a dose-effect relationship between NBP and brain damage. There was dissipation of mitochondrial membrane potential in brain slices after OGD. NBP could prevent the decline of mitochondrial potential in dose-effect dependent way.

Organotypic brain slices； Oxygen and glucose deprivation； N-butyl phthalide； Apoptosis； PI staining

1003-2754(2016)01-0004-05

2015-11-01；

2015-12-16

(河北医科大学第二医院神经内科，神经病学河北省重点实验室，河北 石家庄 050000)

李春岩，E-mail：lichuny@126.com

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