崔曼莉, 张 超, 张明鑫, 王景杰

(第四军医大学唐都医院消化内科，西安 710038；*通讯作者，E-mail：zmx3115@163.com)



HIF-1α与ERBB4在食管鳞癌中的表达及意义

崔曼莉, 张 超, 张明鑫, 王景杰

(第四军医大学唐都医院消化内科，西安 710038；*通讯作者，E-mail：zmx3115@163.com)

目的 探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)和ERBB4在人食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)组织中的表达，并分析两者表达的临床病理意义以及两者的相关性。 方法 采用免疫组化SP法检测65例ESCC组织和50例癌旁组织HIF-1α与ERBB4的表达，分析其与临床病理特征的关系以及两者表达的相关性。 结果 HIF-1α与ERBB4在ESCC组织中的表达的强阳性率分别为83.1%，76.9%，明显高于癌旁组织(30%和24.7%)(P<0.05)；且在分化程度较低、有淋巴转移以及TNM分期较晚的患者中，HIF-1α和ERBB4呈现显著高表达(P<0.05)；而与患者的年龄、性别、是否吸烟、是否饮酒、病变长度以及病变位置均无关(P>0.05)；HIF-1α表达与ERBB4表达之间具有相关性(r=0.629，P<0.05)。 结论 HIF-1α与ERBB4在ESCC中高表达，提示HIF-1α/ERBB4信号通路可能在ESCC发生发展中发挥重要作用。

HIF-1α； ERBB4； 食管鳞癌

食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是亚洲最为常见的消化道恶性肿瘤，且我国约有占全球一半的ESCC患者，故ESCC的预防诊治研究意义重大[1]。肿瘤组织增生过快可以造成局部组织严重缺氧，而肿瘤组织的缺氧在肿瘤形成病理过程中异常重要，与肿瘤治疗耐受、恶性进展及转移密切相关[2]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)在肿瘤细胞耐受缺氧并保持增殖活力的过程中发挥着重要作用，新近研究提示HIF-1α可通过靶向ERBB4调控乳腺分化，并在乳腺癌发生发展中发挥重要作用[3,4]。目前，国内外有关HIF-1α与ERBB4表达关系及其与食管鳞癌关系的研究尚罕见报道。本研究通过免疫组化SP法检测HIF-1α与ERBB4的表达，并分析两者表达的临床病理意义以及两者的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

搜集第四军医大学唐都医院2013-01～2014-12间行食管癌手术切除的患者标本，要求所有病例术前均未行化疗、放疗以及免疫治疗，选取病理资料详实且术后病理证实为ESCC的患者65例，其中男37例，女28例，年龄36-70岁，中位年龄48.5岁。同时在距癌组织边缘>5 cm处的食管正常组织取标本作为癌旁对照，最终经HE 染色确认为无癌组织浸润，无明显炎症细胞浸润的癌旁组织共计50例。标本用体积分数10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制备4 μm切片，进行免疫组化检测观察。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色 HIF-1α兔抗人多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品(sc-10790)，ERBB4兔抗人多克隆抗体为北京博奥森生物技术有限公司产品(bs-1085R)，稀释后作为一抗，通用型SP系列工作液试剂盒(SP-9000)及DAB显色试剂盒(ZLI-9032)购自中山金桥生物公司。采用免疫组化SP法，染色步骤严格按照说明书进行。以已知阳性反应片作为阳性对照，以无关血清代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 结果判定 由两位高年资病理科医生独立评定，当出现分歧时共同评定。蛋白表达均以细胞质或细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，判定方法如下：每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计数1 000个细胞，用各视野中阳性细胞数的平均百分数作为该切片的阳性细胞百分比进行计分：0%-24%为1分，25%-49%为2分，50%-74%为3分，>75%为4分。染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征为标准计分：细胞未着色或呈淡黄色为0分，棕黄色为1分，棕褐色为2分。为进行统计分析，以超过25%细胞呈棕褐色为阳性，余为阴性。

1.3 统计学分析

运用SPSS 13.0统计软件对结果进行处理，计量资料采用卡方检验。所有的检验均为双侧，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α和ERBB4在ESCC组织内的表达

阳性细胞呈片状分布的棕褐色颗粒，阴性对照未见棕黄色颗粒。阳性染色呈散在分布的淡黄色或棕褐色颗粒，HIF-1α定位于细胞核和细胞质，而ERBB4主要定位在细胞质和细胞膜(图1)。HIF-1α在ESCC中的阳性率为83.1%，而在癌旁组织中的阳性率为30%，两者相比差异有统计学意义(P<0.05)；ERBB4在ESCC中的阳性率为76.9%，而在癌旁组织中的阳性率为24.7%，两者相比差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

图1 HIF-1α与ERBB4在ESCC和癌旁组织中的表达 Figure 1 Expression of HIF-1α and ERBB4 in ESCC and non-tumor adjacent tissues (NAT)

表1 HIF-1α与ERBB4在ESCC中的表达

Table 1 Expression of HIF-1α and ERBB4 in ESCC

组织nHIF-1αERBB4低表达高表达χ2P低表达高表达χ2P食管鳞癌65115433.1730.000155031.8570.000癌旁组织5035153812

2.2 HIF-1α和ERBB4在ESCC中的表达及其与临床病理特征的关系

65例患者ESCC组织内HIF-1α高表达者54例，ERBB4高表达者50例。卡方检验显示，HIF-1α和ERBB4的表达与病理分化程度、淋巴转移及TNM分期显著相关(P<0.05)，即在分化程度较低、有淋巴转移以及TNM分期较晚的患者中，HIF-1α和ERBB4呈现高表达。而与患者的年龄、性别、是否吸烟、是否饮酒、病变长度以及病变位置均无关(P>0. 05，见表2)。

表2 HIF-1α与ERBB4的表达与临床病理指标的相关性例

Table 2 Relationship between the expression of HIF-1α and ERBB4 and clinicopathological features of ESCC cases

临床特征nHIF-1αERBB4低表达高表达χ2P低表达高表达χ2P年龄0.0370.8460.4490.503 <60岁437361132 ≥60岁22418418性别1.3690.2460.0750.784 男37829928 女28325622是否吸烟1.0460.3060.0090.923 是446381034 否21516516是否喝酒0.1530.6951.3510.245 是21318318 否448361232TNM分期14.2990.00013.0000.000 Ⅰ-Ⅱ2610161214 Ⅲ-Ⅳ39138336是否淋巴转移6.7620.0094.7820.029 否3610161224 是29128326分化程度7.2510.0124.1470.042 低23023221 高+中4211311329长度0.3650.5460.0330.855 >5cm29425722 ≤5cm36729828位置0.0060.9411.0860.297 下段+中段42735716 上段23419834

2.3 HIF-1α和ERBB4在ESCC中表达的相关性

采用卡方检验对ESCC组织中HIF-1α与ERBB4表达水平的关系进行分析，结果显示在54例HIF-1α强表达的标本中，有48例ERBB4强表达，在11例HIF-1α弱表达的标本中，有9例ERBB4弱表达；二者在统计学上具有相关性(P<0.05，见表3)，χ2换算成Pearson列联系数r为0.629，相关性较强。

表3 HIF-1α与ERBB4在ESCC中表达的相关性

Table 3 Correlation between HIF-1α and ERBB4 expression in ESCC

ERBB4HIF-1α低表达高表达χ2Pr 低表达9625.7370.0000.629 高表达248

3 讨论

缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是调控细胞缺氧应激的关键转录因子，近年来一系列研究提示其可通过激活一系列基因表达参与多种生物学过程从而在肿瘤发生发展中发挥重要作用[5]。HIF-1是一个包含α亚基和β亚基的异二聚体转录因子，其中β亚基持续表达，而α亚基通过感知氧压力决定HIF-1的活性[6]。大量研究证实HIF-1α在包括ESCC的多种组织中表达上调，发挥癌基因功能[7]。meta分析显示，ESCC中HIF-1α表达与肿瘤侵袭、淋巴结转移、疾病分期、治疗耐受以及生存显著相关[8]。我们通过免疫组化研究了HIF-1α在ESCC中的表达发现，其在ESCC中高表达，与病理分化程度、淋巴转移及TNM分期显著相关，与已有报道结果相符[8]。

ERBB4(HER4)属于表皮生长因子受体家族，调控着多种细胞内的反应，包括细胞增殖、生存、侵袭与分化，在肿瘤中发挥重要作用[9]。在ESCC中，ERBB4表达与预后关系密切，且可作为潜在的分子靶标[10,11]。在ESCC的miRNAs研究中，我们发现miR-520a和miR-302b均可通过靶向ERBB4发挥抑癌基因功能[12,13]。免疫组化结果显示，ESCC中ERBB4高表达与病理分化程度、淋巴转移及TNM分期显著相关，说明其发挥癌基因功能。

HIF-1α基因敲除鼠的研究揭示了其对ERBB4的调控及机制：HIF-1α敲除后ERBB4的表达下调，上调HIF-1后则可以激活ERBB4依赖的乳腺癌细胞的分化；体外研究中显示ERBB4的活性与乳腺癌细胞的增殖关系密切，而在4 552例肿瘤及正常组织中，ERBB4与HIF-1α已知的靶基因密切相关[3,4]。因此，HIF-1α通过靶向ERBB4调控乳腺分化，并在乳腺癌发生发展中发挥重要作用。但两者在食管鳞癌中的相关关系未见报道，我们的研究提示，HIF-1α与ERBB4在ESCC组织中的表达具有相关性(r=0.629,P<0.05)，提示在ESCC中HIF-1α也可能对ERBB4有调控作用，且HIF-1α/ERBB4信号通路应该在ESCC发生发展中发挥重要作用，但具体机制及相关功能，仍有待进一步探讨。下一步可通过RNA干扰食管鳞癌细胞系(如Eca109等)抑制HIF-1α后，查看对ERBB4表达的影响，并通过荧光素报告基因明确调控机制，为ESCC的预防诊治提供新的靶点和思路。

[1] Chen W,Zheng R,Baade PD,etal.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66:115-132.

[2] Eales KL,Hollinshead KE,Tennant DA.Hypoxia and metabolic adaptation of cancer cells[J].Oncogenesis,2016,5:e190.

[3] Paatero I,Jokilammi A,Heikkinen PT,etal.Interaction with ErbB4 promotes hypoxia-inducible factor-1α signaling[J].J Biol Chem,2012,287(13):9659-9671.

[4] Paatero I,Seagroves TN,Vaparanta K,etal.Hypoxia-inducible factor-1α induces ErbB4 signaling in the differentiating mammary gland[J].J Biol Chem, 2014,289(32):22459-22469.

[5] Zimna A,Kurpisz M.Hypoxia-inducible factor-1 in physiological and pathophysiological angiogenesis:applications and therapies[J].Biomed Res Int,2015,2015:549412.

[6] Zepeda AB,Pessoa A Jr,Castillo RL,etal.Cellular and molecular mechanisms in the hypoxic tissue:role of HIF-1 and ROS[J].Cell Biochem Funct,2013,31(6):451-459.

[7] Masoud GN,Li W.HIF-1α pathway:role,regulation and intervention for cancer therapy[J].Acta Pharm Sin B,2015,5(5):378-389. [8] Sun G,Hu W,Lu Y,etal.A meta-analysis of HIF-1α and esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) risk[J].Pathol Oncol Res,2013,19(4):685-693.

[9] Appert-Collin A,Hubert P,Crémel G,etal.Role of ErbB receptors in cancer cell migration and invasion[J].Front Pharmacol,2015,6:283.

[10] Xu S,Kitayama J,Yamashita H,etal.Nuclear translocation of HER-4/c-erbB-4 is significantly correlated with prognosis of esophageal squamous cell carcinoma[J].J Surg Oncol,2008,97(1):44-50.

[11] Zhao K,Chen BJ,Chen ZG.ErbB4 as a potential molecular target in the treatment of esophageal squamous cell cancers[J].Scientific World Journal,2014,2014:124105.

[12] Zhang M,Yang Q,Zhang L,etal.miR-302b is a potential molecular marker of esophageal squamous cell carcinoma and functions as a tumor suppressor by targeting ErbB4[J].J Exp Clin Cancer Res,2014,33:10.

[13] 叶文广,姚青林,张明鑫,等.miR-520a调控ErbB4的表达并抑制食管鳞癌细胞的增殖与侵袭[J].南方医科大学学报,2014,34(2):164-168.

Expression and clinical significance of HIF-1α and ERBB4 in esophageal squamous cell carcinoma

CUI Manli, ZHANG Chao, ZHANG Mingxin*, WANG Jingjie

(DepartmentofGastroenterology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China;*Correspondingauthor,E-mail:zmx3115@163.com)

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of HIF-1α and ERBB4 in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).MethodsImmunohistochemistry(SP assay) was used to detect the expression of HIF-1α and ERBB4 in 65 patients with ESCC and 50 non-tumor adjacent tissues(NAT). The relationship between their expression and clinical features was analyzed，and their correlation was also demonstrated.ResultsThe positive expression rate of HIF-1α and ERBB4 was 83.1% and 76.9% in ESCC,respectively, significantly higher than that of NAT(30.0% and 24.7% respectively,P<0.05). And over-expression of HIF-1α and ERBB4 was correlated with tumor differentiation, lymph node metastasis and TNM stage(P<0.05), but showed no statistical associated with sex,age,drink,smoke,tumor length,and location.The expression of HIF-1α was positively correlated with expression of ERBB4(r=0.629，P<0.05).ConclusionHIF-1α and ERBB4 are over-expressed in ESCC, implicating that HIF-1α/ERBB4 signal pathway might play important roles in the ESCC development.

HIF-1α; ERBB4; esophageal squamous cell carcinoma

国家自然基金资助项目(81302055)

崔曼莉，女，1979-03生，硕士，主治医师，E-mail：xixi0011@163.com

2016-06-27

R735.1

A

1007-6611(2016)09-0830-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.011