黄洁琼， 郭昕悦， 侯 栋， 李卫红， 张海燕

(1首都医科大学基础医学院细胞生物学系，北京 100069； 2首都医科大学基础医学院基础医学实验教学中心； *通讯作者，E-mail:culture@ccmu.edu.cn)



重组人激活素A调节人脂肪干细胞中内胚层特异性转录因子表达的机制

黄洁琼， 郭昕悦， 侯 栋， 李卫红， 张海燕

(1首都医科大学基础医学院细胞生物学系，北京 100069；2首都医科大学基础医学院基础医学实验教学中心；*通讯作者，E-mail:culture@ccmu.edu.cn)

目的 研究重组人激活素A(activin A)调节人脂肪干细胞(human adipose stem cells， hASCs)中内胚层特异性转录因子GATA4和FOXA2表达的机制。 方法 将hASCs分为对照组、activin A组和activin A+SIS3组，分别给予相应处理。用免疫细胞化学法和高内涵分析系统测定各组细胞中磷酸化smad3蛋白(p-smad3)、限定性内胚层特异性转录因子GATA4和FOXA2的蛋白水平表达情况，用实时定量PCR法测定GATA4和FOXA2的mRNA水平表达情况。 结果 分组处理细胞30 min，activin A组细胞细胞核中p-smad3的表达显著高于对照组和activin A+SIS3组(P<0.05)；分组处理细胞72 h，activin A组细胞中GATA4和FOXA2的mRNA和蛋白表达显著高于对照组和activin A+SIS3组(P<0.05)。 结论 activin A可活化hASCs细胞内的p-smad3信号，并促进限定性内胚层特异性转录因子GATA4和FOXA2的表达；p-smad3的特异性抑制剂SIS3可阻断activin A对hASCs中p-smad3、GATA4和FOXA2的调节作用。activin A调节hASCs中限定性内胚层特异性转录因子GATA4和FOXA2的表达依赖于p-smad3信号。

人脂肪干细胞； 重组人激活素A； SIS3； 磷酸化smad3蛋白； 内胚层特异性转录因子

在机体发育过程中，限定性内胚层前体细胞在多种信号的调控下分化为肝脏前体细胞，继而形成肝实质细胞。因此，明确人多潜能干细胞定向限定性内胚层前体细胞的分化机制，对于探究肝实质细胞的成熟分化具有重要意义。转录因子是一类能够与特异DNA序列结合并调节基因转录的基因调控蛋白，在调节基因表达、决定细胞属性和诱导细胞分化的过程中发挥着至关重要的作用。在细胞分化过程中，不同的组织特异性转录因子特异地结合到组织或细胞特异性基因的调控元件上，从而启动基因的表达。其中，GATA4和FOXA2是限定性内胚层特异性的转录因子[1]。转录因子GATA4和FOXA2作为先锋转录因子的身份，首先与靶基因特定区域结合，重新配置一个封闭染色体的活化状态[2,3]，使得其他转录因子结合到调节区域。研究表明，在FOXA2与GATA4协同作用下，可通过调节肝实质细胞特异性转录因子如HNF4，CEBP等，促使内胚层细胞向肝实质细胞分化[4]。

本实验室前期的研究结果证实，高浓度重组人激活素A(activin A)的作用可上调人脂肪干细胞(human adipose stem cells,hASCs)中限定性内胚层特异性转录因子GATA4和FOXA2的表达，这些细胞可在多种因子的继续诱导作用下分化为具有功能的肝实质细胞[5]，但activin A是通过何种信号途径发挥作用尚不明确。本研究旨在探讨activin A诱导hASCs中GATA4和FOXA2表达上调的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

DMEM/F12培养基，青霉素-链霉素储存液，胰蛋白酶，反转录试剂盒，实时定量PCR试剂盒，荧光定量96孔PCR板，ABI光学贴膜购自美国Thermo公司；RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；Ⅰ型鼠尾胶原购自美国Invitrogen公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；牛血清白蛋白、SIS3、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)购自美国Sigma-Aldrich公司；重组人激活素A(activin A)购自美国PeproTech公司；兔抗人p-smad3抗体，兔抗人GATA4抗体购自美国Millipore公司；兔抗人FOXA2抗体购自美国ABGENT公司；Alexa Fluor®488标记羊抗兔IgG购自美国Cell Signaling Technology公司；薄壁管，Tips购自美国Axygen公司；焦碳酸二乙酯处理水购自北京赛百盛公司；PCR引物合成购自北京奥科鼎盛公司；直径60 mm细胞培养皿，6孔板购自美国BD公司；Galaxy恒温二氧化碳培养箱购自英国RS Biotech公司；ND-1000分光光度计购自美国Nanodrop公司；Cellomics自动成像显微镜及高内涵图像分析软件购自美国Thermo公司；GeneAmp PCR System 2400 PCR仪，7300 real-time PCR仪购自新加坡ABI公司。

1.2 hASCs的来源与特征

hASC由本实验室建立[5]，体外培养hASCs呈细长、梭形、成纤维细胞样生长；高表达CD90、CD105及CD73抗原；同时表达中胚层特异性基因MEOX1和TBX6及多潜能转录因子OCT4、SOX2、NANOG和SALL4；具有成脂、成骨及成软骨谱系分化的能力。本实验取冷冻保存的第7-9代hASCs经复苏、扩增以及鉴定特征后进行后续研究。

1.3 hASCs的分组及处理

将6孔板用浓度为0.5 mg/ml Ⅰ型鼠尾胶原进行包被，37 ℃静置1 h，吸弃胶原，将培养皿用PBS液漂洗3次。取对数生长期hASCs，经0.05%胰蛋白酶消化后制备成单细胞悬液，按照1.5×104/cm2的密度接种于已包被胶原的6孔板中，分为3组：对照组、activin A组和activin A+SIS3组，每组每孔加入3 ml增殖培养基，置于37 ℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养；当细胞生长达到90%汇合时，吸弃旧培养基，用PBS浸洗细胞2次；加入无血清DMEM-F12基础培养基继续培养48 h。吸弃旧培养基，用PBS浸洗细胞2次，对照组加入3 ml基础诱导培养基(含5 mg/ml牛血清白蛋白的DMEM/F12培养基)，activin A组加入3 ml含100 ng/ml activin A的基础诱导培养基，activin A+SIS3组先加入3 ml含10 μmol/L SIS3的基础诱导培养基作用30 min，再换成3 ml含10 μmol/L SIS3及100 ng/ml activin A的基础诱导培养基，培养30 min时检测p-smad3蛋白的表达，72 h时检测GATA4和FOXA2 mRNA及蛋白的表达。

1.4 免疫细胞化学检测细胞内蛋白的表达

hASC细胞经上述处理后，吸弃旧液，分别加入4%多聚甲醛液，室温固定20 min；吸弃固定液，加入PBS浸洗细胞3次；加入0.3% Triton X-100破膜剂，室温孵育10 min；吸弃上清液，加入封闭用山羊血清，室温孵育60 min；吸弃封闭液，分别加入兔抗人p-smad3(1∶100倍稀释)，兔抗人GATA4(1∶100倍稀释)，兔抗人FOXA2(1∶50倍稀释)，4 ℃孵育过夜；吸弃一抗，加入500 μl PBS浸洗细胞3次；分别加入Alexa Fluro 488标记山羊抗兔IgG(1∶500倍稀释)，37 ℃，避光孵育60 min；吸弃二抗，加入PBS浸洗细胞3次；加入DAPI工作液(1 μg/ml ，室温孵育15 min，复染细胞核；弃去染液，PBS浸洗细胞3次；使用Cellomics®自动成像显微镜获取图像信息，利用高内涵图像分析软件模块分析数据。

1.5 Real-time PCR检测细胞mRNA的水平

利用RNeasy Mini Kit试剂盒，按照说明书提取上述各组细胞总RNA。利用Superscript Ⅲ逆转录试剂盒，按照说明书的步骤将RNA逆转录成cDNA。实时定量PCR检测各基因mRNA表达水平。使用Primer Primer 5软件设计引物，FOXA2上游引物：5′-CGCCCACTTCCAACTACCGC-3′，FOXA2下游引物：5′-GGCTCGTGCCCTTCCATCTT-3′；GATA4上游引物：5′-CCACAAGGCTATGCGTCTC-3′，GATA4下游引物：5′-CTTCTTTGCTATCCTCCAAGTC-3′。引物由北京奥科生物公司合成。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 activin A上调hASCs中p-smad3的蛋白表达

免疫细胞化学染色显示，与对照组相比，100 ng/ml activin A与hASC作用30 min，细胞核中p-smad3的表达明显增加(见图1A)；高内涵分析系统分析每组随机200个细胞的结果显示，与对照组相比，activin A可显著上调细胞核中p-smad3的表达，且这种上调具有统计学差异(P<0.05，见图1B)。

2.2 SIS3抑制hASCs中p-smad3的蛋白表达

免疫细胞化学染色的结果显示，与activin A组相比，经10 μmol/L SIS3预处理30 min，再加入100 ng/ml activin A作用30 min，细胞核中p-smad3的表达明显被抑制(见图2A)；高内涵统计分析分析每组随机200个细胞的结果显示，SIS3预处理组细胞中p-smad3的相对荧光密度明显低于activin A组，二组相比有统计学差异(P<0.05，见图2B)。

图1 免疫细胞化学分析activin A处理后细胞核中p-smad3的表达Figure 1 Immunocytochemistry analysis of the p-smad3 expression after treated with activin A

图2 免疫细胞化学分析SIS3处理后细胞核中p-smad3的表达Figure 2 Immunocytochemistry analysis of the p-smad3 expression after treated with SIS3

2.3 activin A上调hASCs中限定性内胚层特异性转录因子的表达

实时定量PCR的结果表明，activin A作用72 h，hASCs中GATA4和FOXA2的mRNA表达水平明显上调，与对照组相比具有统计学差异(P<0.05，见图3A，3B)。免疫细胞化学染色的结果显示，activin A作用72 h，hASCs细胞核中GATA4的表达明显增强(见图3C)。高内涵分析系统分析每组200个细胞的结果证实，activin A作用72 h，hASCs细胞核中GATA4的表达与对照组相比具有统计学差异(P<0.05，见图3D)。

图3 Activin A处理后hASCs中转录因子GATA4和FOXA2表达的变化Figure 3 Expression of GATA4 and FOXA2 in hASCs after treated with activin A

2.4 SIS3降低activin A对hASCs中限定性内胚层特异性转录因子的上调作用

实时定量PCR的结果表明，加入SIS3后，activin A对hASCs中GATA4和FOXA2 mRNA水平的上调作用被抑制(P<0.05，见图4A，4B)。免疫细胞化学染色的结果显示，加入SIS3后，hASCs细胞核中GATA4的表达明显减弱(见图4C)。高内涵分析系统分析每组200个细胞的结果证实，加入SIS3后，hASCs细胞核中GATA4的表达与activin A组相比具有统计学差异(P<0.05，见图4D)。

3 讨论

本实验室前期的研究表明，体外培养的同质性hASCs表达多潜能转录因子OCT4、SOX2、NANOG和SALL4，100 ng/ml activin A作用72 h可促使hASCs向限定性内胚层及肝实质细胞分化[5]。已有的研究显示，高浓度的Nodal信号可促使限定性内胚层的发生，而activin A可模拟体内的Nodal信号诱导多潜能干细胞分化为限定性内胚层前体细胞[6]。activin A是转化生长因子β超家族中的成员，当其与特异性靶细胞受体ALK4/5结合后，可引起细胞内信号分子smad2和smad3磷酸化，磷酸化的smad2和smad3可与smad4结合形成复合体转运入到细胞核内，调控靶基因的转录[7]。本研究结果表明，activin A可促进hASCs细胞核中p-smad3表达量增加。在培养体系中加入p-smad3的特异性抑制剂SIS3之后，可降低activin A对hASCs细胞核中p-smad3表达的促进作用。由此说明，在hASC中，activin A可通过磷酸化smad3，促进其进入细胞核中发挥作用。最近的研究发现，磷酸化的p-smad3可结合至FOXA2的启动子区，调控FOXA2的表达[8]，这一研究也支持了这一假设，activin A可能通过p-smad3调控hASCs中GATA4和FOXA2的表达上调，从而促使hASCs向限定性内胚层系细胞的活动。

图4 SIS3处理后hASCs中转录因子GATA4和FOXA2表达的测定Figure 4 Expression of GATA4 and FOXA2 in hASCs after treated with SIS3

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Mechanisms of the expression of endoderm specific transcription factors in human adipose stem cells regulated by activin A

HUANG Jieqiong1, GUO Xinyue1, HOU Dong1, LI Weihong2, ZHANG Haiyan1*

(1DepartmentofCellBiology,SchoolofBasicMedicalScience,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2ExperimentalCenterforBasicMedicalTeaching,SchoolofBasicMedicalScience,CapitalMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:culture@ccmu.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the mechanisms of endoderm specific transcription factors GATA4 and FOXA2 induction in human adipose stem cells regulated by activin A.MethodsHuman adipose stem cells(hASCs) were divided into control group, activin A group and activin A+p-smad3 specific inhibitor SIS3 group. Real time PCR, immunofluorescence and high content screening were used to analyze the mRNA expression of GATA4 and FOXA2, and the protein expression of p-smad3, GATA4 and FOXA2, respectively.ResultsThe expression of p-smad3 increased at 30 min in activin A group compared to control group and activin A+SIS3 group(P<0.05). The mRNA and protein expression of GATA4 and FOXA2 significantly increased at 72 h in activin A group compared to control group and activin A+SIS3 group(P<0.05).ConclusionActivin A can activate the p-smad3 signaling in hASCs, and promote the expression of endoderm specific transcription factors, while p-smad3 specific inhibitor SIS3 can block the effect of activin A. The expression of endoderm specific transcription factors GATA4 and FOXA2 in hASCs induced by activin A depends on p-smad3 signaling.

human adipose stem cells; activin A; SIS3; p-smad3; endoderm specific transcription factors

国家自然科学基金资助项目(31171310)

黄洁琼，女，1989-05生，硕士, E-mail:13552309907@163.com

2016-06-14

R392.32

A

1007-6611(2016)09-0803-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.005