李天翥，龚翠

哈尔滨珍宝制药有限公司，黑龙江哈尔滨　150060

按照《中国药典》2015版对不同厂商检验用培养基筛选的考察与研究

李天翥，龚翠

哈尔滨珍宝制药有限公司，黑龙江哈尔滨150060

目的对比不同厂家同类培养基的差异，为微生物限度检查、无菌检查及供应商选择提供依据。方法自2015年10—12月，该公司采用了6株试验菌株，分别考察了北京三药科技开发公司、北京奥博星生物技术有限责任公司、北京陆桥技术有限责任公司、默克化工技术（上海）有限公司4个厂商生产的R2A琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基进行了回收率试验和培养试验。结果回收率试验中，R2A培养基对于枯草芽孢杆菌，默克公司培养基回收率最高，能达到114.9%；SDA培养基对于白色念珠菌和黑曲霉，奥博星公司和默克公司培养基回收率最高，分别能达到151.9%和90.4%；TSA培养基对于枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉等5个菌种，默克公司除在铜绿假单胞菌培养回收率在3个厂家最低，为100.0%外，在其他4个菌种培养中回收率均最高。对于无菌培养用的FT培养基，接种铜绿假单胞菌、生孢梭菌培养物在16 h时，默克公司培养基中可明显观察到浑浊产生，而其他2个厂家需培养至20 h方可观察到阳性现象；对于无菌培养用的TSB培养基，接种枯草芽孢杆菌、黑曲霉培养物在60 h时，默克公司培养基中可明显观察到浑浊产生，快于其他厂家培养基。结论各培养基均能符合药典合格标准，符合微生物计数检查、无菌检查使用需要，默克化工技术（上海）有限公司的培养基培养效果优于其他国产培养基。

培养基；厂商；对比

《中华人民共和国药典》2015年版已由国家食品药品监督管理总局公告发布，自2015年12月1日起实施［1］。《中华人民共和国药典》2015年版较2010版检验用培养基种类发生变化［2］。在工艺用水微生物限度计数中，引入了R2A琼脂培养基取代了营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基。在微生物计数检查法中，采用沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）取代了玫瑰红钠琼脂培养基，用于培养霉菌和酵母菌；采用胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）取代了营养琼脂培养基，用于培养需氧菌。在无菌检查法中，硫乙醇酸盐流体培养基（FT）未发生改变，其用于培养需氧、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）；采用胰酪大豆胨液体培养基（TSB）取代了改良马丁培养基，TSB支持广泛微生物的生长，包括需氧菌、专性和兼性厌氧菌、真菌（主要是需氧菌）［2］修订后的培养基与欧盟和美国药典进一步接轨，如取消了欧盟、美国和ICH都未采用的改良马丁培养基［3-4］。培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验的结果［5-6］，培养基的消耗也是微生物实验室成本的重要组成部分［7］。该公司在2015年版中国药典颁布之际，于2015年10—12月对不同厂家符合2015年药典培养基品种要求的产品进行对比研究，研究目的是对比不同厂家的同类培养基在外观、性状、试验菌生长情况等方面的差异，为微生物限度检查和无菌检查提供依据，为培养基供应商选择提供依据，现将研究过程及结果介绍如下。

1　临床资料

1.1仪器

仪器：HPS-250型生化培养箱；XGI.DTX0.36B型脉动真空灭菌器；HTY-602型集菌仪。

1.2培养基

R2A琼脂培养基：140421（北京陆桥技术有限责任公司），VM686118、VM686116（默克化工技术（上海）有限公司），20151120（北京奥博星生物技术有限责任公司）。沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）：1405132（北京三药科技开发公司），VM682839（默克化工技术（上海）有限公司），20151116（北京奥博星生物技术有限责任公司）。胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）：140703（北京三药科技开发公司），VM676858（默克化工技术（上海）有限公司），20151026（北京奥博星生物技术有限责任公司）。硫乙醇酸盐流体培养基（FT）：1404142（北京三药科技开发公司），VM649391、VM678391（默克化工技术（上海）有限公司），20150610（北京奥博星生物技术有限责任公司）。胰酪大豆胨液体培养基（TSB）：1211022（北京三药科技开发公司），VM631759、VM670259（默克化工技术（上海）有限公司），20151028（北京奥博星生物技术有限责任公司）。各对照培养基来源为中国药品生物制品检定所。

1.3菌种

枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］；白色念珠菌［CMCC（F）98001］；铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］；金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］；黑曲霉［CMCC（F）98003］、生孢梭菌［CMCC（B）64941］。菌种来源为中国医学微生物菌种保藏中心。

2　实验方法

2.1培养基制备

固体培养基：按照培养基配制说明配制培养基，配置后采用验证合格的灭菌程序进行灭菌。制备好的培养基保存在2～25℃、避光的环境，将已灭菌的R2A琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）倒入已灭菌的培养皿中，每皿约30 mL，待冷凝后备用。液体培养基：按照培养基配制说明配制培养基，硫乙醇酸盐流体培养基（FT）分装成12 mL/支、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）分装成9 mL/支，配置后采用验证合格的灭菌程序进行灭菌，制备好的培养基保存在2～25℃、避光的环境备用。

2.2菌液制备

接种枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）上或胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中，接种生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基（FT）中，30～35℃培养18～24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上，20～25℃培养24～48 h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数小于100CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7 d，加入3～5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含孢子数＜100 CFU的孢子悬液。

2.3接种培养

2.3.1固体培养基取≤100 CFU/mL的枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的菌液各1 mL分别加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，将滤膜菌面朝上贴于R2A琼脂培养基平板上，平行制备2个平皿，置30～35℃的培养箱中培养3 d；取≤100 CFU/mL白色念珠菌、黑曲霉的菌液各1 mL分别加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，将滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）平板上，平行制备2个平皿，置20～25℃的培养箱中培养不超过5 d；取≤100 CFU/mL的枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的菌液各1 mL分别加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）平板上，平行制备2个平皿，置30～35℃的培养箱中培养不超过3 d；取≤100 CFU/mL白色念珠菌、黑曲霉的菌液各1 mL分别加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）平板上，平行制备2个平皿，置30～35℃的培养箱中培养不超过5 d；同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验，从16 h开始逐步观察。

2.3.2液体培养基取每管装量为12 mL的硫乙醇酸盐流体培养基（FT）7支，分别接种＜100 CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支作为空白对照，置30～35℃的培养箱中培养3 d；取每管装量为9 mL的胰酪大豆胨液体培养基（TSB）7支，分别接种小于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，置20～25℃的培养箱中培养5 d；同时取相应对照培养基进行对照试验，从接入菌生长时开始观察并记录。

3　结果

3.1R2A培养基对比结果

考察了枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌在R2A培养基中的生长情况，对陆桥、默克和奥博星3个厂家生产的培养基与对照培养基进行了对比，结果见表1、表2。

从培养结果可见，3个厂家的培养基均符合合格标准。对于枯草芽孢杆菌，默克公司的R2A培养基综合回收率最高，能达到114.9%，奥博星公司的R2A培养基综合回收率最低，仅为76.0%。对于铜绿假单胞菌，默克公司和奥博星公司的R2A培养基综合回收率最高，能达到107.8%，陆桥公司的R2A培养基综合回收率较低，但也达到74.5%，从菌落形态来看，奥博星培养基上生长的铜绿假单胞菌菌落与对照培养基比较，菌落稍有不同，释放色素慢且少。

表1　R2A培养基枯草芽孢杆菌回收率试验结果

表2　R2A培养基铜绿假单胞菌回收率试验结果

3.2沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）对比结果

考察了白色念珠菌和黑曲霉在沙氏葡萄糖培养基中的生长情况，对北京三药、默克和奥博星3个厂家生产的培养基与对照培养基进行了对比，结果见表3、表4。

从培养结果可见，3个厂家的培养基均符合合格标准。对于白色念珠菌奥博星公司的培养基综合回收率最高，能达到151.9%，默克公司培养基综合回收率其次，能达到131.5%，三药公司的培养基综合回收率稍低，为83.9%。但是奥博星公司的沙氏葡萄糖培养基质量较不稳定，平行样品生长菌落数量差异较大。对于黑曲霉，默克公司培养基综合回收率最高，达到90.4%，而奥博星培养基回收率最低，仅为76.5%。

表3　SDA培养基白色念珠菌回收率试验结果

表4　SDA培养基黑曲霉回收率试验结果

3.3胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）对比结果

考察了枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉等五个菌种在胰酪大豆胨琼脂培养基中的生长情况，对北京三药、默克和奥博星3个厂家生产的培养基与对照培养基进行了对比，结果见表5、表6、表7、表8、表9。

从培养结果可见，3个厂家的培养基均符合合格标准。默克公司除在铜绿假单胞菌培养回收率在3个厂家最低，为100.0%外，在其他4个菌种培养中回收率均最高。三药培养基在铜绿假单胞菌培养中回收率最高，达到147.1%，但在白色念珠菌培养中回收率最低，仅达到85.5%。奥博星公司培养基在铜绿假单胞菌培养中显示结果较不稳定，平行样品生长菌落数量差异较大，从菌落形态看铜绿假单胞菌菌落与对照培养基比较，菌落稍有不同，释放色素慢且少，从菌落形态看黑曲霉菌落与对照培养基比较菌落也稍有不同，奥博星公司的TSA培养基培养枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉回收率均为最低，分别为88.2%、67.0%、89.7%。

表5　TSA培养基枯草芽孢杆菌回收率试验结果

表6　TSA培养基白色念珠菌回收率试验结果

表7　TSA培养基铜绿假单胞菌回收率试验结果

表8　TSA培养基金黄色葡萄球菌回收率试验结果

表9　TSA培养基黑曲霉回收率试验结果

3.4硫乙醇酸盐流体培养基（FT）对比结果

从硫乙醇酸盐流体培养基溶液性状来看，奥博星培养基与北京三药和默克相比，培养基颜色略深；从溶液氧化层来看，默克公司培养基氧化层优于另外2个厂家。3个厂商的培养基接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和生孢梭菌，培养结果见表10、表11和表12。金黄色葡萄球菌在3个厂家的培养基中均生长良好，与对照培养基未见生长缓慢。接种铜绿假单胞菌、生孢梭菌培养物在16 h时，默克公司培养基中可明显观察到浑浊产生，但在奥博星公司和三药公司培养基中相对生长缓慢，20 h方可观察到阳性现象。

表10　FT培养基金黄色葡萄球菌培养观察结果

表11　FT培养基铜绿假单胞菌观察结果

3.5胰酪胨大豆流体培养基（TSB）对比结果

从胰酪胨大豆流体培养基性状来看，奥博星培养基与北京三药和默克相比，培养基颜色略深，且溶液澄明度较默克与三药略差。3个厂商的培养基接种枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌，培养结果见表13、表14和表15。枯草芽孢杆菌、黑曲霉在3个厂家的培养基中均生长良好，与对照培养基未见生长缓慢。接种白色念珠菌培养物在60 h时，默克公司培养基中可明显观察到浑浊产生，但在奥博星公司和三药公司培养基中相对生长缓慢。

表12　FT培养基生孢梭菌观察结果

表13　TSB培养基枯草芽孢杆菌培养观察结果

表14　TSB培养基白色念珠菌培养观察结果

4　讨论

目前商品化的干粉培养基已经广泛用于制药企业微生物检验，成品干粉培养基具有高效、便利的特点，且生产厂家都有规范的生产工艺和可控的生产环境，能够通过掌控原材料来源以保证培养基质量均一稳定［8］。查阅近年文献，对比不同培养基促生长能力和检查效果的研究比较常见，如不同培养基培养金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌比较研究［9-11］，但对同类培养基不同厂商对比研究的报道较罕见。各制药企业在选购培养基时，主要考察是否能够满足药典要求的适用性试验标准，其次就是考虑经济性，而对培养基是否能够真实反映微生物负荷情况往往没有考虑。

表15　TSB培养基黑曲霉培养观察结果

4.1从RZA培养基回收率试验对比

R2A培养基属于低营养培养基，较以往采用的营养琼脂培养基相比，在水样低污染情况下更有利于微生物的检出［12］。从R2A培养基回收率对比试验结果可见，默克公司的R2A培养基对于枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的回收率均最高，分别能达到114.9%和107.8%，且菌落形态较好，说明默克公司生产的R2A培养基培养效果较好。

4.2从沙氏葡萄糖培养基白色念珠菌、黑曲霉回收率对比

试验结果来看，默克公司培养基对于两种真菌回收率均较高，分别达到131.5%和90.4%，而奥博星公司培养基对于白色念珠菌回收率最高，为151.9%，但一致性略差，且在黑曲霉试验中回收率最低仅为76.5%。综合来看，默克公司生产的沙氏葡萄糖培养基培养真菌效果较好。沙氏葡萄糖培养基培养白色念珠菌结果与杨雪梅［13］研究结果近似，其将稀释成30～100 cfu/mL菌液取1 mL放置在沙氏葡萄糖琼脂培养基中置于25℃、35℃、38℃培养，在其研究表明白色念珠菌在沙氏葡萄糖培养基中，在35℃时生长状态较好，菌落呈现乳白色圆形、比较粘稠、菌落中央有突起，但其未对生长数量进行量化比较，无法进一步与本实验数据进行比较研究。

4.3五种菌种在胰酪大豆胨琼脂培养基回收率对比

试验可见，默克公司除在铜绿假单胞菌培养回收率在3个厂家最低为100%外，在其他4个菌种培养中回收率均最高，综合考虑，默克公司的胰酪大豆胨琼脂培养基优于其他厂商的同类培养基。战宏利等［14］采用北京三药公司的胰酪大豆胨琼脂培养基进行了需氧菌总数计数检查验证试验，所采用菌种与该公司相同，除铜绿假单胞菌回收率低于该公司培养结果外，其余菌种回收率均与该公司结果近似，铜绿假单胞菌不排除人为操作或计数误差等偶然因素所造成的影响。

4.4无菌检查用硫乙醇酸盐培养基和胰酪胨大豆肉汤培养基培养

结果表明，默克公司的2种培养基均能早于其他培养基观察到阳性结果，说明默克培养基中生长状况优于其他2个厂商。卢勉飞等［15］在其研究中以BD公司培养基作为参比，对比了其他3家国产厂商TSB培养基的培养效果，结论为未见明显差异，因其比较方法为计算最终生长菌落数量，且该研究为观察得到阳性结果的培养时间，故在方法上存在不同。

由上述可见，该文所进行对比研究的4个厂商的培养基，包括3个国产厂商和1个进口厂商，从初步研究结果看各培养基培养结果均能符合药典规定，但培养效果来看，进口的各种默克培养基均优于其他国产厂商的培养基。默克公司培养基为颗粒状，便于称量和溶解使用。在综合考虑费效比的情况下，推荐该公司优先选购默克公司培养基。

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Filtration of Different Manufacturer’s Medium Based on the 2015 Edition of Chinese Pharmacopoeia

LI Tian zhu，GONG Cui
Zhenbao Pharmaceutical Co.，Ltd，Harbin，Heilongjiang Province，150060 China

Objective To provide evidence for the suppliers chose，sterility tests and microbial limit examinations are carried out based different medium from different manufacturers.Methods From Oct 2015 to Dec 2015，6 testing stains are used in the recovery rate and the culture experiment in our company.The mediums in used include R2A agar medium，Sabouraud dextrose agar medium，trypticase soy agar medium，fluid thioglycollate culture medium，and pan-creatic casein soya peptone liquid medium.They are supplied by Beijing medicine science and Technology Development Co.，Ltd.，Beijing Aoboxing Biology Technology Co.，Ltd.，Beijing Land Bridge Technology Co.，Ltd，and Merck chemicals（Shanghai）Co.Ltd，respectively.Results The best recoveries of Bacillus subtilis in R2A culture medium is supplied by Merck Co.，which can reach a highest recovery rate of 114.9%.For Candida albicans and Aspergillus niger in SDA culture medium，the best recovery rate can reach 151.9%and 90.4%，respectively.The corresponding suppliers are Aoboxing company and Merck Co.When Bacillus subtilis，Candida albicans，Staphylococcus aureus，and Aspergillus niger grow in TSA culture medium，the highest recovery rate is created by the medium of Merck Co.But recovery rate of Pseudomonas aeruginosa in this company’s medium is the lowest.In the test of Sterile culture with FT medium inoculate in Pseudomonas aeruginosa or clostridium spore，Merck’s culture can be obviously observed in turbid medium inoculate in 16 h.The other cultures need 20 h to get the same results.Merck’s TSB medium，when inoculated with Bacillus subtilis and Aspergillus niger culture in 60 h，can be observed in the production of turbidity.It is faster than other manufacturers.Conclusion All medium consistent with the standards of the pharmacopoeia.All of them comply with the test for sterility and microbial count check.Using the medium from Merck company is a better choice in the inspection methods of microbe limitation and sterility test.

Medium；Manufacturer；Contrast

R9

A

2096-1782（2016）09－0131-07

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.09.131

2016-06-15）

李天翥（1978.8-），女，黑龙江哈尔滨人，硕士，工程师，主要从事药品研发、技术改进、质量体系建设、生产运营管理工作。