洪丽萍，刘变玲，沈蓓莉，肖爱华

1.郑州颐和医院肾内科，河南郑州450000；2.郑州人民医院肾内科，河南郑州　450000

血清miR-21检测在慢性肾脏病并发心血管病变中的意义

洪丽萍1，刘变玲2，沈蓓莉2，肖爱华1

1.郑州颐和医院肾内科，河南郑州450000；2.郑州人民医院肾内科，河南郑州450000

目的探讨血清microRNA-21（miR-21）检测在慢性肾脏病（CKD）并发心血管病变中的意义。方法收集2014年4月—2015年12月来该院就诊或进行例行健康检查的150例CKD患者血清标本，其中以20名健康体检者作为对照。采用实时荧光定量PCR检测血清miR-21表达水平。结果20名健康体检者血清中均检测到miR-21，CKD患者不同分期（1、2、3、4、5期）的血清miR-21检出率分别为53.3%（16/30）、43.3%（13/30）、30%（9/30）、20%（6/30）和6.66%（2/30）。CKD患者随着肾小球滤过率（GFR）值的降低，miR-21的检出率逐渐降低，CKD各分期的miR-21表达水平差异无统计学意义，miR-21表达量与cTnI浓度的相关性差异有统计学意义（r=-0.292，P= 0.0009）。结论CKD患者常伴随有不同程度的心血管病变，miR-21可作为CKD患者心血管病变的早期预警标志。

慢性肾脏病；心血管病变；miR-21

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）往往伴随着不同程度的心血管病变，死于心血管病变的CKD患者占CKD总死亡人数的44%～51%，严重影响患者长期生存［1］。CKD并发心血管病变的患者治疗效果差，预后不良，其危险性正在被人们广泛关注，目前对于该类疾病的治疗主要采取早期预测和早期干预的方式。MicroRNA（miRNA）是近年来备受关注的一类小分子，研究发现miRNA在各种疾病和生理过程中均发挥重要作用［2］。此外，miRNA也被作为一种新兴的生物学标志物用来预测各类疾病的发生发展。最近研究表明miR-21可作为糖尿病肾病的分子诊断标志物［3］，该文通过检测2014年4月—2015年12月来该院进行例行健康检查或就诊的20例健康对照组和150例不同分期CKD患者血清miR-21水平，探讨其在预测CKD患者心血管病变发生中的应用价值，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

该研究共纳入150例心血管病变患者以及20名健康体检者，参与者在2014年4月—2015年12月来该院就诊或进行例行健康检查，均签署了知情同意书，且该研究经郑州人民医院伦理委员会批准。CKD患者的平均年龄为（62.1±16.5）岁，其中男性74例（49%，74/150）、女性76例（51%，76/150），对所有患者进行一般临床资料收集和统计，包括性别、年龄、有无高血压、空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、载脂蛋白a、载脂蛋白b、白蛋白、血肌酐和尿素氮。采用简化肾脏病饮食改良（MDRD）公式计算患者GFR值：GFR［mL/（min·1.73 m2）］=186×血肌酐-1.154×年龄-0.203×（女性×0.742）×（中国人×1.233）。根据《慢性肾脏病及透析的临床实践指南》（简称为K/DOQI指南）对慢性肾脏病患者进行分期：1期，GFR≥90 mL/（min·1.73 m2）；2期，GFR 60～89 mL/（min·1.73 m2）；3期，GFR 30～59 mL/（min·1.73 m2）；4期，GFR 15～29 mL/（min·1.73 m2）；5期，GFR＜15［mL/（min·1.73 m2）］或透析。20例健康体检者作为对照，排除心血管病变及肾脏疾病，平均年龄为（58.6±11.2）岁，其中男女各10名。

1.2血清样本制备

静脉采集空腹外周血3～4 mL于真空采血管，常温下静置40 min，3500 rpm离心10 min，留取上层血清至1.5 mL离心管中，-70°C保存备用。

1.3实时荧光定量PCR

采用Mini Kit miRNA提取分离试剂盒提取血清miRNA，设计miR-21特异性茎环结构逆转录引物以及荧光定量PCR扩增引物，使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒将miRNA逆转录为cDNA，反应程序如下：42°C，50 min；85°C，5 min。采用miRNA qPCR Detection kit结合特异性扩增引物进行实时荧光定量PCR，检测血清miR-21表达水平，反应条件如下：预变性95°C，5 min；变性95°C，10 s；退火60°C，45 s；40个循环，循环结束后执行熔解曲线验证反应产物的特异性，其中以5S rRNA作为内参基因，以2-ΔΔCt方法计算miR-21的相对表达水平：ΔΔCt=肾病（CT-miR-21-CT5s）-健康对照组（CTmiR-21-CT5s）。

1.4肌钙蛋白I（cTnI）浓度检测

严格按照肌钙蛋白微粒子化学发光法（贝克曼公司）检测血清cTnI浓度。

1.5统计方法

使用SPSS 16.0统计学软件对数据进行统计分析，卡方检验或者One way ANOVA分析不同分期CKD各组之间性别、年龄、血糖、血脂、白蛋白、血肌酐、尿素氮等指标的统计学差异，使用Pearson相关性对血清miR-21水平和cTnI浓度进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般临床资料

不同分期CKD患者各30例，其中男女比分别为16/14（1期）、18/12（2期）、15/15（3期）、16/14（4期）和14/16（5期），组间差异无统计学意义（P＞0.05）；其中有高血压的患者例数分别为6（1期）、16（2期）、24（3期）、22（4期）和28（5期），组间差异有统计学意义（P＜0.05）。各组间甘油三酯、总胆固醇、载脂蛋白a和空腹血糖水平均差异无统计学意义（P＞0.05），血肌酐和尿素氮水平随着病情进展逐渐升高，组间差异具有统计学意义（P＜0.05），而HDL-C、LDL-C和白蛋白水平随着病情进展逐步降低，组间差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1　不同分期慢性肾病患者各项临床指标［（±s），mL/（min·1.73 m2）］

表1　不同分期慢性肾病患者各项临床指标［（±s），mL/（min·1.73 m2）］

分期GFR＞9060～9030～6015～30＜15年龄（岁）空腹血糖（mmol/L）甘油三酯（mmol/L）总胆固醇（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）载脂蛋白a（mmol/L）载脂蛋白b（mmol/L）白蛋白（g/L）血肌酐（umol/L）尿素氮（mmol/L）58.3±15.2 5.10±1.21 1.71±0.82 4.34±1.13 1.45±0.32 3.02±0.68 1.32±0.23 0.92±0.21 42.0±4.58 62±15 4.85±0.83 59.2±12.6 4.82±2.10 1.74±0.91 4.42±1.03 1.34±0.25 2.53±0.41 1.31±0.25 0.84±0.23 37.2±4.62 123±19 6.64±1.26 62.3±13.1 4.92±1.35 1.90±0.82 4.36±0.98 1.20±0.23 2.01±0.78 1.22±0.40 0.91±0.24 33.5±5.12 185±84 14.9±6.68 59.4±14.2 5.42±1.26 2.10±0.81 4.45±0.79 1.17±0.38 2.54±0.53 1.25±0.32 0.90±0.45 32.5±4.52 332±291 18.3±8.52 64.1±12.3 5.41±1.10 1.72±1.10 4.47±0.85 1.04±0.28 2.25±0.58 1.15±0.25 0.74±0.53 35.1±5.51 850±298 23.6±7.21

2.2CKD不同分期血清miR-21的检出率

20名健康体检者血清中均检出miR-21，1期、2期、3期、4期和5期CKD患者血清中miR-21的检出率分别为53.3%、43.3%、30%、20%和6.66%。随着GFR值的降低，miR-21的检出率逐渐降低，终末期肾病患者血清miR-21的检出率最低，但与其他各期患者相比，miR-21的相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2　健康对照和不同分期慢性肾病患者血清miR-21检出率比较

2.3CKD患者血清miR-21与cTnI的相关性

研究分析CKD患者血清miR-21与cTnI浓度之间的相关性，结果发现CKD患者血清miR-21表达水平与cTnI浓度呈显著负相关（r=-0.292，P=0.0009）。

3　讨论

近年来，miRNAs已成为研究热点，它是一类含有18～25个核苷酸的内源性非编码RNA，可以通过与其靶基因的3’端非编码区结合，进行基因表达的调控，从而参与各类疾病和生理过程。此外，研究发现miRNA可从受损细胞中释放出来进入到外周血中，被称为循环miRNA，因循环miRNA的检测具有创伤小、稳定性和特异性高的特点，越来越多的被作为生物学指标用来预测各类疾病。在CKD中，同样发现大量异常表达的miRNA，Neal等人发现血清miR-16、 miR-21、miR-155和miR-210在CKD中均下调，且与eGFR密切相关［4］。

人类miR-21位于染色体17q23.2，早期研究发现miR-21在多种肿瘤发生发展过程中的细胞增殖、生长、凋亡、侵袭和转移等发挥重要作用［5］。后来人们逐渐认识到miR-21参与糖尿病肾病的发病机制，且在糖尿病肾病动物模型的肾脏组织中高表达，miR-21可通过调节多条信号通路和关键基因参与糖尿病肾病的发生［6］。在IgA肾病患者中，发现miR-21高表达与肾纤维化密切联系，被认为具有促进肾纤维化的作用［7-8］。近期，左琪等人在CKD患者的尿沉渣中发现miR-21水平较健康组有所升高（19.68±23.85比5.50± 2.99），但差异无统计学意义（P＞0.05），还证实尿沉渣中miR-21水平肾间质纤维化、eGFR存在相关性（r= 0.440，P=0.031；r=-0.811，P＜0.001）［9］。

该研究中，通过检测不同分期CKD患者血清miR-21水平，发现随着GFR值的降低，miR-21的检出率逐渐降低（1期、2期、3期、4期和5期分别为53.3%、43.3%、30%、20%和6.66%），终末期肾病患者血清miR-21的检出率最低，但与其他各期患者相比，miR-21的相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05），提示血清miR-21可作为预测CKD发展的一个生物学指标。Van Craenenbroeck等人也检测了CKD患者（n=32）血清中miR-21表达，发现较健康组（n=12）相比略有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）［10］。由于以上研究并未划分CKD患者的分期，同时样本量也较小，可能是造成与该研究结果不一致的可能原因。在另一项研究中，Neal等［4［4］。以上结果与该研究基本一致，但Neal等人的研究并未观察1期和2期CKD患者血清中miR-21的表达，无法与该研究全部结果进行比较。研究人员近期在鱼类模型中发现肾脏miR-21通过促增殖和抗凋亡作用在维持高效的肾小球再生过程中发挥重要功能，具体地来说，当肾损伤时，通过注射anti-miR-21抑制miR-21表达可延缓肾脏再生功能［11］，该结果提示肾脏中miR-21表达对肾损伤后的再生和恢复具有重要意义。

另一方面，该研究还探讨了血清miR-21与CKD患者心血管病变之间的关系。cTnI具有高度心肌特异性和灵敏性，在无心肌损伤时，血液cTnI含量非常低，其浓度的升高预示着心肌细胞损伤，因此cTnI被认为是目前心肌损伤最好的确定标志物。该文使用Pearson相关性分析发现血清miR-21水平与cTnI浓度存在负相关。表明miR-21水平与CKD患者心血管病变存在联系，也提示miR-21可作为CKD患者血管病变的预示指标。而在最新发表的一项研究中，发现血清miR-21在急性心肌梗塞患者中显著上调，同时与多项心肌损伤标记物如肌酸激酶、肌酸激酶-MB和cTnI存在相关性，并可作为急性心肌梗塞一个潜在的诊断标志物（AUC=0.892，P＜0.05）［12］。以上结果提示miR-21与心肌损伤存在关联，但其具体作用及其可能机制尚需进一步确认。

综上，血清miR-21检测在CKD合并血管病变的发生发展中具有重要指示意义，随着miR-21在CKD中分子机制的不断深入研究，不仅可将miR-21作为CKD合并血管病变的诊断指标，同时还可作为治疗CKD的靶点，因此具有广阔的应用前景。

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Significance of Detection of Serum miR-21 in Chronic Kidney Disease Complicated with Cardiovascular Disease

HONG Li-ping1，LIU Bian-ling2，SHEN Bei-li2，XIAO Ai-hua1
1.Department of Internal Medicine，Zhengzhou Yihe Hospital of Henan，Zhengzhou，Henan Proivnce，450000 China；2. Kidney Internal Medicine，Zhengzhou People's Hospital of Henan，Zhengzhou，Henan Province，450000 China

Objective To investigate the significance of serum microRNA-21（miR-21）detection in chronic kidney disease（CKD）complicated with cardiovascular disease.Methods Serum samples from 150 patients in our hospital for routine health examination with CKD were collected from December 2014 to April 2015，and 20 healthy subjects were used as control.The expression level of miR-21 in serum was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results 20 cases of miR-21 were detected in sera of healthy persons and CKD patients with different stage（1，2，3，4，5）of serum miR-21 detection rate was 53.3%（16/30），43.3%（13/30）and 30%（9/30），20%（6/30）and 6.66%（2/ 30）respectively.CKD patients with glomerular filtration rate（GFR）value decreased，the detection rate of miR-21 decreased gradually and CKD stage of miR-21 expression level difference was not statistically significant expression of miR-21 in volume and cardiac troponin I（cTnI correlation was statistically significant（r=0.292，P=0.0009）.Conclusion CKD patients often accompanied with different degrees of cardiovascular disease，miR-21 can be used as the early warning signs of cardiovascular disease in patients with CKD.

Chronic kidney disease；Cardiovascular disease；miR-21

R446.11

A

2096-1782（2016）09－0062-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.09.062

2016-06-15）

洪丽萍（1981.12-），女，河南信阳人，硕士，主治医师，研究方向：慢性肾炎。

肖爱华（1964.1-），女，河南遂平人，本科，主任医师，研究方向：糖尿病肾病，慢性肾脏病一体化治疗，E-mail：xah6569@sina.com。