高泽莉，汪宏云，叶　梅，李　莉，周　丽，郭　峰

(四川省攀枝花学院附属医院血液科　617000)



淋巴细胞亚群及血细胞抗体检测在再生障碍性贫血中的临床意义*

高泽莉，汪宏云，叶梅，李莉，周丽，郭峰

(四川省攀枝花学院附属医院血液科617000)

目的探讨再生障碍性贫血患者外周血淋巴细胞亚群及血细胞抗体水平的变化及临床意义。方法采用流式细胞仪检测25例再生障碍性贫血患者(重型再生障碍性贫血7例，非重型再生障碍性贫血18例)及20例健康志愿者(对照)外周血淋巴细胞亚群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD16+CD56+)及血细胞抗体(抗血小板抗体、抗红细胞抗体及抗粒细胞抗体)。结果再生障碍性贫血组患者CD4+T淋巴細胞百分比、CD4/CD8比值，CD56+百分比明显降低(P<0.05)；血细胞抗体(血小板抗体、红细胞抗体、粒细胞抗体)阳性率明显高于对照组(P<0.05)。结论再生障碍性贫血患者细胞免疫功能异常，同时血细胞膜上抗体阳性率高，提示体液免疫也存在异常。

再生障碍性贫血；淋巴细胞亚群；血细胞抗体

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)是一类主要由T淋巴细胞介导造血组织损伤而导致的骨髓造血衰竭综合征。近年来，越来越多研究发现，细胞免疫是其主要发病机制，包括Th/Ts细胞失衡及CD8+T细胞过度活化、Treg细胞的明显降低等有关。目前，细胞免疫功能T淋巴细胞亚群的研究较多，但对AA患者血细胞抗体的研究却很少。本研究应用流式细胞仪对25例AA患者的外周血淋巴细胞亚群及血细胞抗体进行了检测，旨在观察二者在AA发病中的变化及临床意义，以便指导治疗及病情观察。

1　资料与方法

1.1一般资料全部AA病例均为本院住院或门诊患者，根据血常规和骨髓检查及骨髓活检确诊，符合张之南《血液病诊断及疗效标准》。将研究对象分为两组，AA组：男13例，女12例；重型AA 患者7例，非重型AA患者18例；年龄4～68岁，中位年龄35岁；(2)健康志愿者(对照组)：男11例，女9例，中位年龄32岁。主要试剂及仪器：流式细胞仪为美国贝克曼五色流式细胞仪，淋巴细胞亚群试剂盒及血细胞抗体试剂盒(Beckman公司,America)。试剂为鼠抗人单克隆抗体，溶血素为全血溶血试剂，为BEKMAN COULT A11895。

1.2方法

1.2.1淋巴细胞亚群检测方法采集外周静脉血3 mL，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝后，流式细胞仪检测淋巴细胞亚群表达，包括CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD16+CD56+等。直接免疫荧光法：荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过荧光标记固定、溶血步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。

1.2.2血细胞抗体检测方法采集外周静脉血3 mL，EDTA-K2抗凝后，直接免疫荧光法。FITC标记的各型单克隆抗体，加到全血样本中，与粒细胞膜、血小板膜、红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，报告百分数。

2　结　　果

2.1AA组与对照组淋巴细胞亚群的比较AA组CD3+平均值(70.00±12.25)%，与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，AA组CD4+T淋巴细胞平均值为(32.50±5.61)%，明显低于对照组(P<0.05);CD8+平均值为(39.70±5.02)%，明显高于对照组(P<0.05)，CD4/CD8比值，平均值为(0.90±0.26)%，与对照组比明显降低(P<0.05)，CD56+平均值(7.94±4.51)%,明显低于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2AA组与对照组外周血血细胞抗体的比较血小板抗体PAIGG平均值(2.30±1.94)%，明显高于对照组(P<0.05)，

表1　　AA组与对照组淋巴细胞亚群的比较±s)

表2　　AA组与对照组血细胞抗体的比较±s)

血小板抗体PAIGA平均值(2.22±2.09)%，明显高于对照组(P<0.05),血小板抗体PAIGM平均值(8.27±9.93)%，明显高于对照组。红细胞抗体IGG(0.40±0.23)%,明显高于对照组(P<0.05)，红细胞抗体IGA(1.17±1.76)%,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，红细胞抗体IGM平均值(2.25±1.60)%，明显高于对照组(P<0.05)，粒细胞抗体IGG平均值(1.86±1.20)%，，明显高于对照组(P<0.05),粒细胞抗体IGA平均值(3.38±5.26)%，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),粒细胞抗体IGM平均值(5.16±6.82)%，明显高于对照组(P<0.05)，见表2。

3　讨　　论

传统学说认为AA是原发、继发干细胞缺陷、造血微环境异常及免疫异常3种机制导致的骨髓造血功能衰竭。目前，多数学者认为AA患者的发病机制为T细胞功能异常、细胞免疫亢进并以骨髓为靶器官的自身免疫性疾病。其T细胞亚群失衡、CD8比例增高、CD4/CD8比例倒置[1-2]。

本研究表明AA患者总T细胞与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但CD4/CD8比值异常，主要见于重型AA，而非重型AA的CD4/CD8多正常。

CD19是B细胞标志之一，本研究表明，AA中B细胞数量下降有6个，B淋巴细胞的数量增加的有3个，B细胞数量变化与血细胞抗体改变不一致，B细胞数量增加或减少的患者都有血细胞抗体的高表达。提示AA患者可能存在B细胞功能异常，体液免疫在AA发病机制中的作用尚无定论。目前，已陆续有文献提及体液免疫在AA发病机制中的作用，可能仍有一定的体液免疫参与。但并不是直接参与，也可能不是原发因素而是继发效应所致。也有研究报道是通过表达协同刺激分子途径或调节性T细胞途径影响AA患者T淋巴细胞活化[3]。

CD16+56+是NK细胞的特性标志，参与肿瘤、感染、免疫调节。本研究发现AA患者NK+减少的有6例，均为重型AA，说明AA患者NK细胞免疫功能明显受损的。较多文献提及NK细胞在AA患者中数量是减低的，NK细胞表面同时存在抑制性受体和活化性受体，但抑制性受体居主导地位，表现为NK细胞对自身正常组织细胞不产生杀伤作用，NK细胞的降低减弱了T淋巴细胞的调节作用，导致免疫功能失衡。在Fas缺陷的小鼠模型中，NK细胞在体外可以抑制自身反应性B淋巴细胞，而在体内将NK细胞清除后则会加重自身免疫性疾病的程度[4-8]，提示NK细胞减少在AA发病机制中起一定作用。

本研究同时进行了成熟血细胞抗体的测定。红、粒细胞抗体包括IGG、IGM、IGA，血小板抗体包括PAIGG、PAIGA、PAIGM。成熟血细胞抗体测定目前较少文献提及。刘惠等[9]研究较多的为免疫相关性血细胞减少(immuno-related hemocytopenia，IRH)，此病为自身抗体损伤和(或)抑制骨髓不成熟造血细胞导致的造血功能低下，骨髓造血细胞自身抗体是由T淋巴细胞调控失衡导致B淋巴细胞数量/亚群/功能异常，进而产生的一类抗体。刘惠等[9]对此病的拟诊标准：(1)两系或全血细胞减少，网织红细胞比例不低，骨髓中红系比例正常或偏高，易见红系造血岛及红细胞吞噬现象；(2)除外其他原发或继发血细胞减少症如AA、MDS、PNH相鉴别。其确诊标准为FCM检测到骨髓造血细胞膜自身抗体即可确诊(治疗前确诊)，若未检测到骨髓未成熟造血细胞膜上自身抗体，但对激素、静脉用丙球蛋白等免疫抑制剂有效仍可确诊[8-9]。

作者没有检测干祖细胞抗体，而是检测外周血成熟血细胞抗体。本研究发现，AA患者血细胞抗体均为阳性5/25(20%)，红细胞抗体阳性6/25(24%)，粒细胞抗体阳性9/25(36%)，血小板抗体阳性10/25(40%)。与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，尤其以IGM型血细胞抗体为主，提示AA患者也存在体液免疫的异常。自身抗体针对骨髓造血细胞膜上何种抗原，这些抗原如何被递呈并激活TH2细胞，目前文献不多，还有待进一步研究。付蓉等[10]发现部分IRH患者自身抗体可作用于骨髓红系造血细胞膜上的促红细胞生成素受体(EPOR)，封闭EPOR信号转导，导致红系较早阶段增殖和分化受抑，EPOR可能为自身抗体作用的靶点之一。血细胞抗体阳性的AA患者如何与IRH鉴别？AA是一种以骨髓造血组织为靶器官，T细胞免疫功能亢进的自身免疫性疾病，为细胞免疫亢进，血常规网织红细胞及中性粒细胞百分比明显降低，淋巴细胞比例升高，骨髓减低或重度减低。而IRH为体液免疫亢进，B淋巴细胞比例超过正常，而且亚群失衡，特别是CD5+B淋巴细胞明显多于健康者及AA患者，IGg1及IGg3水平增高，血常规网织红细胞及中性粒细胞百分比不低，巨核细胞不少，骨髓易见红系造血岛或嗜血现象，对糖皮质激素及静脉用丙球蛋白疗效好，起效快[11]。

淋巴细胞亚群联合血细胞抗体的测定，不仅可以帮助探讨AA的发病机制，也可以指导临床用药，组内2例AA患者，血象及骨髓象恢复后，复查淋巴细胞亚群及血细胞抗体仍异常，因在其他医院停药及减量导致病情复发，当重

新使用环孢素后患者血常规又恢复，故作者根据此2项结果来决定用药时间和调整药物剂量[12]。当AA患者血象和骨髓象即使恢复正常后，若淋巴细胞亚群及血细胞抗体仍为阳性时，建议适当延长用药时间。

[1]Kordasti S,Marsh J,Al-Khan S,et al.Functional characterization of CD4+T cells in aplastic anemia[J].Blood,2012,119(9):2033-2043.

[2]林果为．现代临床血液病学[M]．上海：复旦大学出版社，2013：365-368．

[3]文瑞婷，蔡静怡，吴国才，等．B淋巴细胞活化因子在再生障碍性贫血发病中的作用[J]．广东医学院学报，2014，32(5)：624-625．

[4]Liu C,Li Z,Sheng W,et al.Abnormalities of quantities and functions of natural killer cells in severe aplastic anemia[J].Immunol Invest,2014,43(5):491-503.

[5]Li ZS,Shao ZH,Fu R,et al.Percentages and functions of natural killer cell subsets in peripheral blood of patients with severe aplastic anemia[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2011,91(16):1084-1087.

[6]曹萍，蒋莎义，谢晓恬，等．儿童再生障碍性贫血淋巴细胞亚群及与血常规相关性的研究[J]．同济大学学报:医学版，2011，6(6)：70-73．

[7]何维，曹雪涛，熊思东．医学免疫学[M]．2版．北京：人民卫生出版社，2011：135．

[8]付蓉，陈瑾，王红蕾，等．骨髓cooms试验阳性血细胞减少症患者调节性T细胞数量及功能状态[J]．中华医学杂志，2010，90(42)：2989-2992．

[9]刘惠，付蓉，邵宗鸿．免疫相关性血细胞减少症的诊断及鉴别诊断[J]．临床血液学杂志，2013，26(4)：437-439．

[10]付蓉，刘惠，王珺．骨髓单个核细胞cooms试验阳性血细胞减少患者骨髓红系造血细胞膜靶抗原初步研究[J]．中华医学杂志，2012，92(38)：2689-2693．

[11] Shi J,Ge M,Lu S,et al.Intrinsic impairment of CD4+CD25+regulatory T cells in acquired aplastic anemia[J].Blood,2012,120(8):1624-1632.

[12]陆春伟，佟海侠，陆美言．再生障碍性贫血患者外周血淋巴细胞亚群和调节性T细胞的检测及临床意义[J]．中国医科大学学报，2010，46(10)：865-867．

Clinical significance of detecting lymphocyte subsets and hematocyte antibody in aplastic anemia

GaoZeli，WangHongyun，YeMei，LiLi，ZhouLi,GuoFeng

(DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofPanzhihuaUniversity,Panzhihua，Sichuan617000，China)

ObjectiveTo investigate of the change of peripheral blood lymphocyte subsets and blood cell antibodies in aplastic anemia and its clinical significance.MethodsThe lymphocyte subsets CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+，CD3-CD19+，CD3-CD16+CD56+from 25 aplastic anemia(including SAA 7 cases，NSAA18 cases)，and hematocyte antibody detection(granulocyte,erythrocyte,platelet cytomembrane) and 20 controls were examined by flow cytometry.ResultsCD4+T lymphocyte percentage,CD4/CD8 ratio,the percentage of CD56+in aplastic anemia patients significantly decreased(P<0.05).Blood cell antibodies (platelet antibody,erythrocyte antibody,granulocyte antibody) were significantly higher than the control group (P<0.05).ConclusionAplastic anemia cellular immune function in patients is abnormal,and antibody positive rate is high,and it prompt that humoral immunity is also abnormal.

anemia aplastic;lymphocyte subsets;hematocyte antibody

高泽莉(1971-)，副主任医师，本科，主要从事临床再生障碍性贫血研究。

论著·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.012

R556.5

A

1671-8348(2016)07-0903-02

2015-09-14

2015-11-19)