代佑果,李为明,唐辉蓉,姚　乾,崔　进△

(1.昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院，昆明 650118；2.昆明医科大学第二附属医院，昆明 650101)



论著·临床研究

生理性深层海水联合热疗治疗肝细胞癌的体外抑瘤研究*

代佑果1,李为明2,唐辉蓉2,姚乾1,崔进2△

(1.昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院，昆明 650118；2.昆明医科大学第二附属医院，昆明 650101)

目的探讨生理性深层海水(PDSW)联合热疗对肝细胞癌的体外抑瘤作用。方法将取自我国海南省海域的深层海水进行制备，制成PDSW，检测所含有的部分元素。体外培养的正常肝细胞和人肝癌QGY-7703细胞被随机分为PDSW组和生理盐水组，PDSW组加入PDSW，生理盐水组给予等量生理盐水，24 h后，每天分别接受40 ℃热疗6 h和43 ℃热疗1 h，在热疗后的24、48、72 h，用MTT法检测热疗结合PDSW对正常肝细胞及人肝癌QGY-7703细胞的抑制率。同时检测PDSW及生理盐水在40 ℃ 6 h连续10 d状态下对人肝癌QGY-7703细胞克隆形成率的影响。结果MTT检测结果显示肿瘤抑制率在两组均呈时间和浓度依赖性。PDSW组的肿瘤抑制率明显较生理盐水组高，差异有统计学意义(P<0.05)。PDSW组对正常肝细胞的生长抑制率明显低于生理盐水组。此外，PDSW组的肿瘤细胞克隆形成率较生理盐水组低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论PDSW能够提高正常肝细胞对热的耐受性。当联合热疗时，可明显抑制人肝癌QGY-7703细胞生长。

癌，肝细胞；生理性深层海水；热疗；耐受力

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1深层海水取自海南省琼海市海域，海平面200 m以下，避光运至昆明，室温避光储存。在0.3 MPa压力下，经5.00 μm、1.00 μm聚丙烯熔喷PP棉超微过滤后，用铜锌合金(KDF)除去海水中的重金属，反复冻融方法浓缩并去除海水中多余的盐分浓缩海水，0.01 μm PVC合金超滤膜除细菌、部分病毒和微小杂质，活性炭吸附异味，电感耦合等离体质镨(ICP-MS)多次检测PDSW中部分元素的含量后，制备成PDSW备用。

1.1.2细胞株人肝癌QGY-7703细胞株由云南省肿瘤研究所提供。正常肝细胞由云南省肿瘤研究所提供。

1.1.3主要试剂RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品；新生小牛血清为美国Costar公司产品；十二烷基硫酸钠(SDS)、二甲基酰胺(DMF)和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)为上海生工生物工程有限公司产品；MTT：美国Amresco公司产品。

1.2方法

1.2.1细胞抑制率检测(改良MTT比色法)取对数生长期的肿瘤细胞株及正常肝细胞株经0.25%胰酶消化，调细胞浓度为2×105个/mL接种于96孔板，培养24 h。然后进行分组,每组设6个平行孔，其中空白对照组:只加培养基；对照组:培养细胞，不加药；试验组：海水终浓度梯度为100%(即PDSW)、50.00%、25.00%、12.50%、8.33%、6.25%；阳性对照组：盐水终浓度梯度为0.90%、0.45%。上述各组再根据热疗温度不同设37 ℃、40 ℃及43 ℃ 3个组，每组根据热疗时间(次数)再分为24 h(热疗1次)、48 h(热疗2次)、72 h(热疗3次)3个组。热疗：其中一组每天把培养箱的温度提高到40 ℃，持续6 h后，再把培养箱的温度恢复到37 ℃；另一组每天把培养箱的温度提高到43 ℃，持续1 h后，再把培养箱的温度恢复到37 ℃。37 ℃组按常规进行细胞培养法培养。终止热疗作用：分别在热疗后的24、48、72 h每孔加入5 mg/mL的MTT 20.00 μL，继续培养4 h。各孔加入20% SDS 50% DMF裂解液溶解甲瓒结晶，震荡后过夜。用酶标仪于580 nm测定光密度(OD)值，以OD值表示细胞增殖情况。

1.2.2癌细胞克隆形成率检测每试验点设3复孔(24孔板)，每孔接种2×102个人肝癌QGY-7703细胞，24 h后分别加入生理盐水(NS)或PDSW。每3天换液。连续观察7～10 d，计数各孔克隆数(细胞数大于或等于50判定为克隆)。克隆形成率(%)=克隆数目/接种细胞数×100%，计算各孔克隆形成率。

1.11 统计学分析 应用SPSS22.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，多组间对比采用单因素方差分析，两两对比采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1加PDSW或NS进行37 ℃常规培养对正常肝细胞增殖的抑制作用 37 ℃正常培养状态下，加PDSW或NS对正常肝细胞均没有明显的抑制作用，24、48、72 h各时段两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1　37 ℃常规培养时，加PDSW或NS对正常肝 细胞增殖的抑制率

2.2加PDSW或NS分别进行40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h热疗对正常肝细胞增殖的平均抑制率40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h加NS或PDSW对正常肝细胞增殖的平均抑制率均呈时间依赖性(图2)，即随着热疗时间延长，抑制率也随着增加；且加NS的抑制率较加PDSW者明显。

2.3同一温度下，PDSW组及NS组对正常肝细胞增殖的抑制率在同一温度(40 ℃或43 ℃)下，各时间点，PDSW组对正常肝细胞增殖的抑制率均较NS组小(P<0.05)。就PDSW组来说，40 ℃ 6 h与43 ℃ 1 h比较,差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

2.4同一时间、同一温度，不同浓度海水对正常肝细胞增殖的抑制率同一时间(24、48、72 h)、同一温度(40 ℃或43 ℃)热疗时，各组随着海水浓度增加，抑制率增强，呈现出浓度依赖的特点，即随着海水浓度增大，PDSW加热疗对正常肝细胞增殖的抑制率增强。未被稀释的PDSW(即海水原液：硬度为3 000 ppm的深层海水)组的抑制率最强，见图4。

图2　不同时间、不同温度，加PDSW和NS对 正常肝细胞增殖的抑制率

图3　同一温度下，PDSW组及NS组对正常 肝细胞增殖的抑制率

图4　同一时间、同一温度，不同浓度海水对正常 肝细胞增殖的抑制率

2.5同一时间、同一温度下，加NS与PDSW(海水原液)对正常肝细胞增殖的影响同一时间(24、48、72 h)、同一温度(40 ℃或43 ℃)下，在体外，PDSW加热疗对正常肝细胞增殖的抑制率均低于NS(P<0.05)，见图5。

图5　同一时间、同一温度下，加NS与PDSW 对正常肝细胞增殖的抑制率

2.6加PDSW或NS进行37 ℃常规培养对人肝癌QGY-7703细胞增殖的抑制作用在37 ℃正常培养状态下，加PDSW对人肝癌QGY-7703细胞增殖有明显的抑制作用，24、48、72 h各时段与NS组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

图6　37 ℃常规培养时，加PDSW或NS对人肝癌 QGY-7703细胞增殖的抑制率

2.7加PDSW或NS分别进行40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h热疗对人肝癌QGY-7703细胞增殖的平均抑制率40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h加NS或PDSW对人肝癌QGY-7703细胞增殖的平均抑制率呈时间依赖性(图7)，即随着热疗时间延长，抑制率也随着增加；且PDSW组的抑制率较NS组明显。

图7　不同时间、不同温度，加NS和PDSW对人肝癌 QGY-7703细胞增殖的抑制率

2.840 ℃ 6 h与43 ℃ 1 h热疗比较，加NS组或PDSW组的各时段对体外培养的人肝癌QGY-7703细胞增殖的影响40 ℃ 6 h与43 ℃ 1 h热疗比较，加NS组或PDSW组的各时段的抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图8。

图8　40 ℃ 6 h与43 ℃ 1 h热疗比较，加NS组 或PDSW组的各时段对体外培养的人肝癌 QGY-7703细胞增殖的抑制率

2.9同一时间、同一温度，不同浓度的深层海水对人肝癌QGY-7703细胞增殖的抑制率同一时间(24、48、72 h)、同一温度(40 ℃或43 ℃)热疗时，各组随着海水浓度增加，抑制率增强，呈现出浓度依赖的特点，即随着海水浓度增大，PDSW加热疗对人肝癌QGY-7703细胞增殖的抑制率增强。PDSW(即海水原液)组的抑制率最强，见图9。

2.10同一时间、同一温度下，加NS与PDSW(海水原液)对人肝癌QGY-7703细胞增殖的影响同一时间(24、48、72 h)、同一温度(40 ℃或43 ℃)下，在体外，PDSW加热疗对人肝癌QGY-7703细胞增殖的抑制率均高于NS加热疗(P<0.05)，见图10。

图9　同一时间、同一温度，不同浓度海水对人肝癌 QGY-7703细胞增殖的抑制率

图10　同一时间、同一温度下，加NS与PDSW对人肝癌 QGY-7703细胞增殖的抑制率

2.11同一时间、同一温度，加PDSW对正常肝细胞和人肝癌QGY-7703细胞增殖的影响从总体上看，PDSW加40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h热疗在24、48、72 h均可以对肝癌QGY-7703细胞起到较好的抑制作用，同时对正常肝细胞产生较小的影响，见图11。

图11　同一时间、同一温度，加海水对正常肝细胞和人肝癌 QGY-7703细胞增殖的抑制率

2.12PDSW对人肝癌QGY-7703细胞克隆形成率的抑制作用经过10 d培养，PDSW组人肝癌QGY-7703细胞克隆形成较少(图12A)，而在NS克隆形成明显(图12B)。进行统计分析发现，40 ℃ 6 h热疗10 d后各组克隆形成率比较，PDSW组的克隆率明显较NS组少，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

A:NS组；B：PDSW组。

图12　加NS或PDSW 40 ℃ 6 h热疗10 d后，人肝癌 QGY-7703细胞克隆形成情况 表1　　40 ℃ 6 h热疗10 d后两组各培养孔 肿瘤细胞克隆形成率(n=3)

3　讨　　论

原发性肝癌是我国比较常见的恶性肿瘤,其恶性程度较高,起病隐匿,早期多无明显症状，一旦发现,大多已属中晚期,目前缺乏有效的治疗药物。因而,为中晚期原发性肝癌患者寻找行之有效的治疗方法已成为医疗界最紧迫的任务之一。热疗可以抑制肿瘤血管形成及促进癌细胞凋亡[3]，正逐渐成为一种有希望的肝癌治疗手段。

体外实验研究发现，细胞的生存率会随着加热的温度和时间而变化,温度越高、作用时间越长，疗效将呈指数性递增[4-5]。根据癌细胞对热的临界温度(或称为阈温度)不同，热可以发挥两方面的作用，在阈温度以下热诱导细胞凋亡为热作用的主要机制,而阈温度以上则主要引起细胞坏死,细胞损伤程度呈指数性递增[6-7]。细胞株的种类不同，阈温度也不一样,差异颇大,一般认为大多数细胞株的临界温度介于42.5～43.0 ℃。本试验发现，在同一组别(NS组或PDSW组)，40 ℃ 6 h的热疗对人肝癌QGY-7703细胞的抑制率与43 ℃ 1 h比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明提高热疗的温度或延长作用时间，均可增加热疗的细胞毒作用，从而可为温和热疗[平台期生物体核心温度(39.8±0.2)℃，恒温期6 h]治疗肿瘤奠定基础，在温和热疗作用下，随着治疗时间延长，可以达到高温热疗同样的效果。

内环境的维持靠各种微量元素的平衡，只有在稳定的内环境下，机体的功能才能正常发挥。海水是为人类提供“平衡微量元素”的最好资源[7]。与表层海水比较，深层海水具有以下特点：低温、洁净性、富含平衡易吸收的微量元素、氧化还原水、pH值呈弱碱性[8]。饮用深层海水可纠正元素异常，恢复患者的钙(Ca)/镁(Mg)比例，以及铝(Lv)、汞(Hg)和铅(Pb)水平[9]。长期饮用深层海水可促进机体的元素平衡，如其中的钠(Na)和钾(K)均衡有助于维持机体的酸碱平衡[10]；Ca和Mg比例的适当对调节脂代谢及维持心血管系统的正常功能尤为重要[11-12]。在本试验中发现，加入PDSW，正常肝细胞对热的临界温度提高，耐热能力增强，而肝癌QGY-7703细胞的临界温度相反降低，耐热能力降低。推测由于癌细胞结构异常(如Na+-K+ATP等异常)，即使在给予平衡元素的基础上也难以纠正自身的元素失衡，造成对热耐受力降低，相关机制需要进一步研究。

此外，深层海水具有直接抑制肿瘤侵袭或转移的作用，Kim等[13]的研究表明PDSW对乳腺癌的侵袭/转移具有抑制作用，由此认为PDSW通过预防肿瘤转移，有望改善癌症患者的生存。本研究发现在37 ℃正常培养状态下，PDSW对体外培养的人肝癌QGY-7703细胞的增殖能力具有明显的抑制作用，且这种抑制具有时间及浓度依赖的特点，其抑制机制推测可能与Kim等报道的结果类似，相关研究有待进一步深入。

总之，本研究结果表明PDSW能够提高正常肝细胞对热的耐受性。在正常体温(37 ℃)状态下，PDSW对体外培养的人肝癌QGY-7703细胞的增殖能力具有明显的抑制作用。当与热疗联合使用时，PDSW能够改变癌细胞对热的临界温度，增加热疗的抗癌效果，相关机制需要更多研究支持。

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The anti-cancer effects of physiological deep-sea water combined with hyperthermia for hepatocellular carcinoma in vitro*

DaiYouguo1,LiWeiming2,TangHuirong2,YaoQian1,CuiJin2△

(1.theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity/TumorHospitalofYunnanProvince,Kunming,Yunnan650118,China;2.theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650101,China)

ObjectiveTo explore the anti-cancer effects of physiological deep-sea water(PDSW) combined with hyperthermia for hepatocellular carcinoma in vitro.MethodsDeep-sea water (DSW) from the south Chinese sea was processed,and made into PDSW,detection of some elements.In vitro,the cultured normal liver cells and human hepatoma QGY-7703 cells were randomly divided into PDSW group and normal saline(NS) group,the NS group received saline,the PDSW group received different concentrations of PDSW.Two groups were heated respectively to 6 h of 40 ℃ or 1 h of 43 ℃，24,48,72 h after the administration of PDSW or saline,the normal liver cells and QGY-7703 cells proliferation capacity and toxicity were investigated by MTT assay.At the same time testing PDSW and NS in 40 ℃ 6 h for 10 d state of human liver QGY-7703 cell clone formation rate.ResultsThe results of MTT assay showed that tumor inhibitory rate were time and concentration dependent in tow groups.Tumor inhibitory rate of PDSW group in different time was significantly higher than NS group (P<0.05).On the other hand,the inhibitory of hepatocyte for PDSW group in different time were significantly lower than NS group.In addition,the clone formation rate of PDSW group was lower than those of NS group(P<0.05).ConclusionPDSW can improve the heat tolerance of normal liver cells.When combine with heat,it can obviously inhibit the growth of human liver cancer QGY-7703 cells.

carcinoma，hepatocellular;deep-sea water;hyperthermia;tolerance

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.011

云南省科技厅-昆明医科大学联合专项基金资助项目(2010CD166)。作者简介：代佑果(1978-)，副教授，博士，主要从事肝癌的基础与临床研究。△

，E-mail:yncuijin@126.com。

R282.77

A

1671-8348(2016)07-0899-04

2015-09-08

2015-11-22)