庞春艳，王　蓓，剧锦哲，王永福

(内蒙古科技大学包头医学院风湿免疫研究所/包头医学院第一附属医院风湿免疫科，内蒙古包头 014010)



α-胞衬蛋白siRNA对人涎腺导管细胞的影响*

庞春艳，王蓓，剧锦哲，王永福△

(内蒙古科技大学包头医学院风湿免疫研究所/包头医学院第一附属医院风湿免疫科，内蒙古包头 014010)

目的观察α-胞衬(α-Fodrin)蛋白小干扰RNA(siRNA)对人涎腺导管(HSG)细胞的影响，探讨α-Fodrin siRNA治疗干燥综合征(SS)的作用。方法实验分对照组、空载体组、α-Fodrin siRNA1组及α-Fodrin siRNA2组，将成功构建的10 μg α-Fodrin siRNA1和α-Fodrin siRNA2表达载体分别采用脂质体法转染HSG细胞，空载体组HSG细胞转染等剂量的pGFP-V-RS空载体。转染后24、48、72和96 h观察细胞转染效率，实时荧光定量(RT)-PCR法检测4组HSG细胞中α-Fodrin mRNA的表达水平；细胞荧光免疫法检测4组细胞中α-Fodrin蛋白的表达水平；ELISA法检测4组细胞上清液中IFN-γ、IL-10的表达水平。结果转染后48 h HSG细胞转染效率最高；转染后48 h α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组 HSG细胞中α-Fodrin mRNA和蛋白的表达水平明显低于对照组和空载体组(P<0.05)，且α-Fodrin siRNA2组中α-Fodrin mRNA的表达水平低于α-Fodrin siRNA1组的表达水平(P<0.05)；α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组细胞上清液中IL-10的水平明显升高，较对照组和空载体组差异有统计学意义(P<0.05)，α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组细胞上清中IFN-γ的水平低于对照组和空载体组，但 4组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论HSG细胞转染α-Fodrin siRNA载体后，α-Fodrin mRNA和蛋白的表达水平下降，同时细胞上清中IL-10的水平升高、IFN-γ水平下降，提示α-Fodrin siRNA可以减轻炎性反应，为SS的治疗提供实验依据。

RNA,小分子干扰；α-胞衬蛋白；人涎腺导管细胞；白细胞介素-10；干扰素-γ

α-胞衬(α-Fodrin)蛋白是从干燥综合征(sjögren′s syndrome，SS)小鼠唇腺中提取的涎腺特异性自身抗原，在SS的发病过程中起非常重要的作用，对SS的诊断和指导治疗都起到了很好的作用，有较好的特异度和灵敏度[1-2]。人涎腺导管(human salivary gland cells,HSG)细胞来源于人下颌下腺的闰管上皮，常作为研究SS的细胞模型。本研究采用小干扰RNA(siRNA)技术沉默HSG细胞中α-Fodrin 基因的表达，探讨α-Fodrin基因的siRNA对HSG细胞的可能作用。

1　材料与方法

1.1主要试剂载体pGFP-V-RS和TRIzol分别购自Origene和Takara公司，M-MLV逆转录酶、脂质体lipofectamineTM2000和标记有红色荧光的二抗购自Invitrogen公司，ELISA试剂盒为RD国内分装试剂盒，购自上海生工生物工程有限责任公司，兔抗人的一抗购自Abcam公司。

1.2siRNA的设计针对人α-Fodrin基因的cDNA序列(序列号:XM_006717254)，根据siRNA靶点设计软件(http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/)设计2段siRNA序列，分别位于全序列的第238～256位和第405～423位，第1段序列为：CCC TTA GGC GTC AGA AGC T，第2段序列为：GCT GAA GTG CAG GCC AAC T，这2段siRNA序列的GC含量是一样的，只是在人α-Fodrin全序列的位置不同。本实验将上述2段序列的模板插入质粒载体pGFP-V-RS的启动子下游，构建2段α-Fodrin 的siRNA真核表达载体。

1.3细胞水平的各项检测本实验分4组，分别为对照组、空载体组、α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组，将α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组中的HSG细胞分别转染α-Fodrin siRNA1和α-Fodrin siRNA2真核表达载体10 μg和脂质体lipofectamineTM2000的混合物(比例为1∶3)，对照组转染等剂量空载体与lipofectamineTM2000的混合物(比例为1∶3)。转染48 h后，采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，反转录成cDNA，实时荧光定量(RT)-PCR法检测各组细胞中α-Fodrin mRNA和内参GAPDH的Ct值，计算2-ΔΔCt。同时，4组细胞做细胞荧光免疫检测染色，图片采用IPP6软件分析平均OD值；ELISA法检测细胞上清中IFN-γ和IL-10的变化，根据标准曲线计算出IFN-γ和IL-10的水平。

2　结　　果

2.1成功构建α-Fodrin的siRNA真核表达载体构建的2段α-Fodrin siRNA真核表达载体送invitrogen公司进行DNA基因测序分析，结果显示α-Fodrin的2段siRNA序列已准确无误地插入质粒载体pGFP-V-RS中，见图1。

2.2荧光显微镜观察HSG细胞转染效率α-Fodrin的siRNA真核表达载体和空载体转染后24、48、72、96 h荧光显微镜下观察细胞绿色荧光，结果显示转染后48 h绿色荧光最亮最多，见图2，即细胞转染效率最高。

2.3α-Fodrin的siRNA真核表达载体转染48 h后α-Fodrin mRNA的表达水平HSG细胞转染48 h后，α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组α-Fodrin mRNA的表达明显低于对照组和空载体组，差异有统计学意义(P<0.05)，α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4α-Fodrin的siRNA真核表达载体转染48 h后α-Fodrin蛋白的表达水平HSG细胞转染48 h后，细胞荧光免疫的结果显示：α-Fodrin siRNA1组的平均OD值为(0.011 9±0.000 6)，α-Fodrin siRNA2组的平均OD值为(0.008 6±0.000 6)，对照组的平均OD值为(0.014 7±0.000 7)和空载体组的平均OD值为(0.016 7±0.001 9)，α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组α-Fodrin蛋白的表达低于对照组和空载体组，差异有统计学意义(P<0.05)，同时α-Fodrin siRNA2组的α-Fodrin蛋白的表达低于siRNA1组，差异也有统计学意义(P<0.05)，对照组和空载体组α-Fodrin蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

A:α-Fodrin siRNA1组；B:α-Fodrin siRNA2组。

图1α-Fodrin的siRNA真核表达载体(10×20)

A：HSG细胞的明视野；B：A对应的绿色荧光。

图2　　HSG细胞的转染效率(10×20) 表1　　4组细胞中α-Fodrin mRNA表达水平

A：对照组；B：空载体组；C：α-Fodrin siRNA1组；D：α-Fodrin siRNA2组。

图34组HSG细胞中α-Fodrin蛋白的表达水平

2.5α-Fodrin的siRNA真核表达载体转染48 h后细胞上清中IFN-γ的表达水平细胞转染48 h后α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组细胞上清中IFN-γ的水平低于对照组和空载体组，但差异无统计学意义(P>0.05)，4组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2　　4组细胞上清中IFN-γ表达水平

2.6α-Fodrin的siRNA真核表达载体转染48 h后细胞上清中IL-10的表达水平细胞转染48 h后α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组细胞上清中IL-10的水平高于对照组和空载体组，差异有统计学意义(P<0.05)，α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3　　4组细胞上清中IL-10表达水平

3　讨　　论

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术自发现以来就引起了研究者的极大关注，因其具有高效性、特异性等优点，这使得RNAi技术广泛用于基因功能和治疗多种疾病等方面的研究，尤其是用于治疗自身免疫性疾病[3-5]、肿瘤[6-7]的研究。Pauley等[3]将 caspase-3的特异性siRNA序列和M3受体激动剂胆碱连接，转染HSG细胞，以受体介导的细胞内吞的方式将siRNA带入HSG细胞内，它可以明显抑制caspase-3在基因和蛋白水平的表达。Yu等[8]构建TNF-α siRNA的腺病毒载体注射小鼠，可有效沉默小鼠假体周围组织中的TNF-α的表达，从而抑制骨溶解。

Fodrin在大多数哺乳动物细胞均有表达，本研究成功构建的2段siRNA真核表达载体并转染HSG细胞，结果发现α-Fodrin siRNA1组和siRNA2组中HSG细胞的α-Fodrin mRNA的表达与对照组和空载体组比较明显下降，充分说明α-Fodrin的特异性siRNA能在基因水平上沉默其表达。本研究进一步采用细胞荧光免疫法检测HSG细胞中α-Fodrin的蛋白表达情况，结果显示：α-Fodrin siRNA1组和α-Fodrin siRNA2组α-Fodrin的蛋白表达水平与对照组和空载体组比较明显减弱，差异有统计学意义，说明α-Fodrin siRNA能抑制α-Fodrin在蛋白水平的表达。

Th依据分泌细胞因子模式的不同分为Th1和Th2，Th1主要分泌IFN-γ等，Th2主要分泌IL-4、IL-6等，Th1和Th2在体内保持平衡，二者的失衡在自身免疫病的发病机制中具有重要作用[9-11]。本研究结果发现，与对照组比较，α-Fodrin的siRNA作用HSG细胞后，IL-10的水平明显升高，而IFN-γ的水平下降，但不明显。提示α-Fodrin的siRNA可以减轻炎性反应，同时逆转HSG细胞中Th1和Th2的失衡，使二者保持平衡。

本实验设计的第2段siRNA序列抑制α-Fodrin mRNA和蛋白水平的表达作用强于第1段siRNA序列，差异有统计学意义，而两段siRNA序列对IFN-γ和IL-10的作用没有明显差别。提示本实验的第2段siRNA序列具有更好的基因沉默效果，但对炎性反应的作用没有明显差别。本研究结果发现，α-Fodrin的siRNA可以降低Th1细胞相关的细胞因子，升高Th2细胞相关的细胞因子，逆转Th1和Th2的失衡，保持Th1和Th2的平衡。本课题组从细胞水平观察了α-Fodrin siRNA对HSG细胞的作用，为SS的基因治疗提供实验依据。

本研究采用构建α-Fodrin siRNA质粒载体转染细胞，转染后48 h转染效率最高，但经流式细胞术鉴定也只能达到40% 左右，因此，α-Fodrin siRNA虽然能抑制α-Fodrin mRNA和蛋白水平的表达，但检测细胞上清中细胞因子却没有明显的改变，可能和其转染效率不是很高有关系。接下来本研究团队将构建腺病毒载体，从而大幅度提高其感染HSG细胞的效率，进一步检测细胞上清中细胞因子、细胞周期和细胞凋亡的变化，进行深入研究。此外，本研究只是通过检测部分细胞因子的表达而间接推测T细胞亚群的变化，而不是直接证明T细胞亚群的变化，因此是不充分的。后续本团队将研究siRNA对SS患者的外周血单个核细胞或SS动物模型NOD小鼠脾细胞的作用，从而直接说明siRNA对T细胞亚群的影响。

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论著·临床研究

论著·基础研究

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.006

Effect of α-Fodrin siRNA on human salivary gland cells*

PangChunyan,WangBei,JuJinzhe,WangYongfu△

(InstituteofRheumatologyofBaotouMedicalCollege,InnerMongoliaUniversityofScienceandTechnology/DepartmentofRheumatology,theFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou,Mongolia014010,China)

ObjectiveTo observe the effect of α-Fodrin siRNA on human salivary gland(HSG)cells and to discuss its therapy on sjögren′s syndrome(SS).MethodsThe vectors expressing siRNA against α-Fodrin of human were transfected into HSG cells of 10 μg α-fodrin siRNA1 group and α-Fodrin siRNA2 group,while pGFP-V-RS vector were transfected into the cells of empty vector group，there was no handling in HSG cell of control group.The efficiency was observed by fluorescence microscope after transfection of 24,48,72 and 96 h by lipofectamine 2000.The expression levels of α-Fodrin mRNA and protein of HSG were detected by real-time(RT)-PCR and immunohistochemistry method respectively.The expression levels of IFN-γ and IL-10 in supernatant of cells were detected by ELISA.ResultsThe efficiency was highest on 48 h after transfection.The level of α-Fodrin mRNA and protein was lower in α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group than control group and empty vector group on 48 h after transfection (P<0.05),the level of α-Fodrin mRNA in α-fodrin siRNA2 group was significant higher than α-fodrin siRNA1 group (P<0.05).The levels of IL-10 were higher in α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group than control group and empty vector group on 48 h after transfection (P<0.05),α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group had no statistical significance(P>0.05).The levels IFN-γ in α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group were lower than of control group and empty vector group on 48 h after transfection,but there were no significant differences in the four groups (P>0.05).ConclusionThe α-fodrin siRNA1 and α-fodrin siRNA2 can suppress the levels of α-fodrin mRNA and protein of HSG cells,at the same time;they can elevate the expression of IL-10 and decrease the level of IFN-γ.So α-Fodrin siRNA reduce the levels of inflammatory cytokines and provide experimental basis to therapy of SS.

RNA,small interfering;α-Fodrin protein;human salivary gland cells;interleukin-10;interferon-γ

包头市医药卫生基金项目(2009S1001-34)；内蒙古自治区科技计划项目(20120403)。作者简介：庞春艳(1978-)，主管检验师，硕士，主要从事免疫性疾病研究工作。△

，E-mail:wyf5168@hotmail.com。

R373.9

A

1671-8348(2016)07-0880-03

2015-09-18

2015-11-28)

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.007

胡辅华(1973-)，副主任医师，硕士，主要从事眼科疾病研究工作。