陈海霞,周业江,王璐璐,李　华,熊玉霞△

(1.泸州医学院药学院药理教研室，四川泸州 646000；2.泸州医学院附属医院普外科，四川泸州 646000)



·论著·

他莫昔芬对人胃癌细胞增殖和丝氨酸蛋白酶抑制剂9表达的影响*

陈海霞1,周业江2,王璐璐1,李华1,熊玉霞1△

(1.泸州医学院药学院药理教研室，四川泸州 646000；2.泸州医学院附属医院普外科，四川泸州 646000)

目的研究他莫昔芬(TAM)对胃癌细胞雌激素受体α、β(ERα和ERβ)的表达情况及对胃癌细胞增殖和丝氨酸蛋白酶抑制剂9(PI9)表达的影响。方法对前期筛选出的ERα表达阳性胃癌细胞株MNK45、SGC7901(PI9表达阳性)和ERβ表达阳性胃癌细胞株BGC823(PI9表达阴性)，采用免疫荧光化学法检测TAM对ERα和ERβ表达的影响，CCK8法检测TAM干预后胃癌细胞株的增殖情况，逆转录PCR观察TAM干预后PI9表达的变化。结果ERα表达于MNK45和SGC7901细胞核上，ERβ 表达于BGC823细胞核上，经TAM干预后ERα和ERβ表达均无明显改变；TAM在0.1～100.0 μmol/L时可明显抑制SGC7901、MNK45的细胞增殖，与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)，对BGC823和MNK28的细胞增殖无明显剂量依赖关系；TAM干预后SGC7901的PI9 mRNA的相对灰度值为(0.402±0.020)，MNK45的PI9 mRNA的相对灰度值为(0.359±0.048)，较阴性对照组灰度值均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论TAM对ERα和PI9阳性表达细胞的增殖抑制作用强于PI9阴性表达细胞，并呈较好的剂量依赖性；TAM对胃癌的生长抑制作用可能与改善PI9介导的免疫耐受有关。

胃肿瘤；受体,雌激素；他莫昔芬；丝氨酸蛋白酶抑制剂 9

胃癌是源自胃黏膜上皮的恶性肿瘤，占我国恶性肿瘤发病率的第2位，死亡率的第3位，严重威胁人类健康[1-2]。本课题前期研究显示雌激素(estradiol)可促进胃癌细胞的增殖，与其能内源性诱导丝氨酸蛋白酶抑制剂9(serine proteinase inhibitor 9，PI9)mRNA的表达密切相关，从而造成胃癌的内源性免疫逃逸。雌激素受体(ER)抑制剂他莫昔芬(tamoxifen，TAM)，又名三苯氧胺其是否可以通过抑制PI9的表达来发挥疗效？目前还未见相关报道。本研究通过观察TAM干预后4株人胃癌细胞的增殖情况及对PI9 mRNA表达的影响，明确雌激素受体抑制剂能否改善PI9介导的免疫耐受，研究结果将为改善胃癌的免疫治疗效果提供新的策略。

1　材料与方法

1.1材料TAM(Adamas Reagent公司)，DMEM high glucoses培养液(HyClone公司)，免疫荧光化学试剂主要包括：ERβ兔抗人多克隆抗体、ERα鼠抗人单克隆抗体(美国Bioworld公司)，山羊抗兔IgG 为罗丹明标记、山羊抗小鼠IgG为FITC标记(中杉金桥)；逆转录PCR(RT-PCR)Kit(美国Bioworld公司)。倒置相差显微镜(Olympus CKX31SF)，生物安全柜(BSG-4珠海L型)，96孔培养板(美国Corning公司)，荧光倒置显微镜(S70-Germany)，多功能PCR仪(TC-412，英国TECHNE)，DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，荧光凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养人胃癌细胞MNK45、SGC7901、MNK28和BGC823购自北京北纳创联生物技术研究院，于5%CO2浓度、37 ℃条件下用含10% 胎牛血清、1%双抗贮存液的DMEM培养液培养。

1.2.2免疫荧光化学法检测ERα和ERβ的表达取对数生长期的细胞经0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为1.0×105/mL，均匀接种到内铺有盖玻片的培养皿中。待细胞贴壁生长接近单层时，用PBS漂洗3次，每次5 min，预冷的4%多聚甲醛固定20 min，甲醇-20 ℃细胞通透15 min，10% 胎牛血清封闭30 min。加入鼠抗人ERα(1∶200稀释浓度)和兔抗人ERβ(1∶50稀释浓度)各50 μL，阴性对照用10% 胎牛血清代替一抗。4 ℃孵育过夜后，加入羊抗小鼠IgG(FITC标记)和羊抗兔IgG(罗丹明标记)二抗稀释液，37 ℃避光孵育30 min后洗涤，晾干、封片拍照观察。以明确的荧光为阳性，仅发浅荧光且与周围背景区别不明显则判为阴性或弱阳性(FITC标记显绿色，罗丹明标记显红色)。

1.2.3CCK8法检测细胞增殖抑制率取对数生长期细胞MNK45、SGC7901、MNK28和BGC823，胰酶消化后调整细胞密度为2×105/mL，接种于96孔板，90 μL/孔，置培养箱中培养24 h。根据前期实验结果，TAM给药组加入10.00 μmol/L的雌激素后，再将不同浓度的TAM溶液(100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μmol/L)加入96孔板，10 μL/孔，设阴性对照组加DMEM 10 μL，空白对照组加无血清DMEM 100 μL，溶媒对照组加 1% 甲醇10 μL，每组3复孔。37 ℃继续培养24 h，每孔加CCK8溶液10.00 μL，4 h后，用酶标仪测定各孔光密度(OD)值(450 nm处)。实验重复3次，计算细胞增殖抑制率(%)=(OD对照组-OD给药组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

1.2.4RT-PCR检测PI9基因表达水平TAM给药组先在各细胞中加入雌激素10.00 μmol/L，再加入TAM 10.00 μmol/L 作用24 h后，按照RNAsimple Total RNA Kit说明提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定核酸纯度OD260/280在1.0～2.0。严格根据GenBank数据库人PI9基因序列设计PCR引物(表1)，参照RT-PCR Kit说明逆转录合成cDNA，以PI9的引物进行PCR扩增。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 mim，总循环35个，72 ℃延伸5 min。PCR产物取5 μL于2%琼脂糖凝胶电泳，最后用Bio-Rad凝胶成像采集系统照相并进行分析。

2　结　　果

2.1胃癌细胞 ERα 和 ERβ 的表达MNK45的ERα位于细胞核呈清晰的绿色颗粒，为强阳性表达；SGC7901的ERα为弱阳性表达；而ERβ仅在BGC823细胞核上显淡红色颗粒，为弱阳性表达。经10.00 μmol/L浓度的TAM作用后ERα和ERβ表达未见明显改变，结果表明TAM对雌激素受体的表达无影响，见图1。

表1　　GAPDH和PI9引物序列

A1:MNK45 ERα;B1:SGC7901 ERα;C1:BGC823 ERβ。A2:MNK45 ERα;B2:SGC7901 ERα;C2:BGC823 ERβ。

a:P<0.05,与阴性对照组比较。

2.2TAM对胃癌细胞增殖活性的影响检测结果显示，MNK45和SGC7901在0.10～100.00 μmol/L，随药物浓度增高OD值逐渐降低，与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。TAM作用MNK45、SGC7901胃癌细胞24 h后，表现出不同程度的细胞增殖抑制作用，且抑制作用随药物浓度的增加而增强，呈剂量依赖性，在浓度达到100.00 μmol/L时存活率明显下降，抑制率分别达(93.92±3.77)%、(82.17±0.79)%；不同浓度的TAM对BGC823和MNK28细胞生长抑制无明显剂量依赖关系，在100.00 μmol/L时对MNK28产生最大抑制效应，达(31.78±7.38)%，见图2。

2.3TAM对胃癌细胞PI9mRNA表达的影响经TAM药物处理24 h后，MNK45和SGC7901细胞PI9 mRNA的相对灰度值分别为(0.359±0.048)、(0.402±0.020)，较对照组PI9 mRNA的相对灰度值分别为(0.540±0.065)、(0.545±0.038)明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)；MNK45、SGC7901细胞的GAPDH及PI9电泳结果与预计扩增产物的大小一致，分别在450、217 bp处出现阳性条带，见图3。

图2　　TAM对4株胃癌细胞的浓度抑制率曲线

A:MNK45细胞PI9 mRNA电泳条带图；1:阴性对照组；2：TAM给药组。B:SGC7901细胞PI9 mRNA电泳条带图；1:TAM给药组；2：阴性对照组。C:PI9 mRNA灰度相对值柱状图。

图3TAM对和胃癌细胞PI9 mRNA表达的影响

3　讨　　论

胃癌症状不明显，早期诊断困难，患者临床治疗多属晚期，预后较差，与日韩等国相比，我国胃癌还具有发病率和病死率高等特点[2]。目前多数研究[3-4]报道TAM 治疗ER阳性消化道肿瘤的疗效佳，但对ER阴性肿瘤不明显，故TAM作为胃癌的临床辅助化学治疗存在一定争议[5]，这与胃癌组织中ER的表达不具普遍性有关系。Xie等[6]的研究中指出TAM可通过抑制蛋白激酶C信号通路，加速肿瘤相关蛋白的降解过程，促进ER阳性胰腺癌细胞凋亡。白文坤等[7]研究表明，不同浓度的TAM可通过影响人肝癌HepG2细胞ER的表达抑制肝癌细胞增殖，并具有时间-浓度依赖。TAM是最常用的非甾体类雌激素拮抗剂，通过竞争性抑制雌激素与ER结合发挥生物学效应[8-9]，有研究还表明可抑制雌激素诱导的乳腺癌细胞中PI9的合成[10]，是ER阳性原发性乳腺癌治疗的一线药物[11]。

目前有关PI9在肿瘤治疗的研究已成为热点，但其表达生物学意义及在肿瘤免疫治疗方面尚不明了。本课题前期研究结果提示雌激素与胃癌细胞上ER结合可直接诱导PI9 基因转录，对颗粒酶B(granzyme B，GrB)诱导的细胞凋亡有明显的抑制作用，而介导胃癌的内源性免疫逃逸[12-13]。GrB是丝氨酸蛋白酶家族的重要成员，能迅速引起靶细胞DNA断裂，导致细胞凋亡[14]。最近研究发现，PI9在肿瘤细胞发生发展中占有重要作用，它对PFP/GrB路径和Fas/Fas-L路径介导的细胞凋亡均有抑制作用[15]。Fas是细胞膜上肿瘤坏死因子受体，和Fas-L结合可介导细胞凋亡，故Fas/Fas-L表达异常对肿瘤的生长、免疫逃逸有着很大影响[16]。在肿瘤形成的过程中，PI9合成增加可能导致Fas 表达下调或缺失，肿瘤细胞从而获得抵抗 Fas 介导凋亡的免疫性逃逸机会。前期研究亦发现PI9在胃癌中的表达不是全阳性，在癌组织中PI9阳性率约为41.0%，在癌细胞株中为50.0%。因此，本课题以前期研究筛选出的ERα表达阳性胃癌细胞株MNK45、SGC7901(PI9阳性)和ERβ表达弱阳性胃癌细胞株BGC823(PI9阴性)作为研究对象，探讨TAM作用于胃癌细胞与PI9表达的关系。若能根据胃癌患者PI9表达的检测结果，制订个体化的TAM辅助化学治疗方案，可能会收到更好的疗效。

本研究结果显示不同浓度的TAM作用MNK45、SGC7901胃癌细胞24 h后，表现出明显的细胞增殖抑制作用，且呈剂量依赖性；TAM可减弱胃癌细胞MNK45、SGC7901的PI9 基因表达水平，较阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明TAM具有明显的PI9抑制效应，在一定程度上改善了PI9介导的免疫耐受。这一结果提示以PI9为靶标的免疫治疗将成为胃癌治疗的新方向，为临床上治疗消化道肿瘤提供了一定的理论基础，为雌激素受体抑制剂的临床应用提供有力的证据。

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论著·基础研究

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.005

Effects of Tamoxifen on proliferation and expression of serine proteinase inhibitor 9 in human gastric cancer cells*

ChenHaixia1,ZhouYejiang2,WangLulu1,LiHua1,XiongYuxia1△

(1.DepartmentofPharmacology,CollegeofPharmacy,LuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo observe the expression of estrogen receptors (ERα and ERβ) on gastric cancer cells and evaluate the effect of Tamoxifen(TAM) on the cell proliferation and expression of serine proteinase inhibitor 9(PI9) of gastric cancer cells.MethodsPI9 positive expression(MNK45,SGC7901)and negative expression (BGC823)of gastric cancer cell lines were from preliminary screened,the expression of ERα and ERβ detected by immunofluorescence chemical method,the cell proliferation and expression of PI9 were tested by CCK8 assay and reverse transcription-PCR after intervention of TAM.ResultsERα protein expression was noted in MNK45 and SGC7901,ERβ was noted in BGC823,but the expression of ERα and ERβ were not appear to be obvious after the intervention of TAM.Tamoxifen could obviously inhibited cell proliferation of MNK45 and SGC7901 at concentration of 0.1-100.0 μmol/L,the differences were statistically significant compared with negative control group (P<0.05),but showed no dose-dependent to the proliferation of BGC823 and MNK28.After treating with TAM,the expression of PI9 mRNA of SGC7901(0.402±0.020) and MNK45(0.359±0.048) were obviously lower than that in the negatwe control group(P<0.05).ConclusionTamoxifen could significantly inhibit the proliferation of PI9 positive expression than PI9 negative expression of gastric cancer cell lines,and showed obviously dose-dependent,its role in inhibiting proliferation might closely related to immune tolerance improved by PI9.

gastric neoplasms；receptor,estrogen；Tamoxifen；serine proteinase inhibitor 9

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.003

国家自然科学基金资助项目(30672058)；泸州医学院科研基金资助项目(2009246)。作者简介：陈海霞(1982-)，讲师，硕士，主要从事抗炎免疫和肿瘤药理学研究。△

，E-mail:xyx_cell@163.com。

R735.2

A

1671-8348(2016)07-0873-03

2015-09-08

2015-11-26)