林茂锐，周　旋，李明友，黄基伟，刘桂治，曹东林



84株沙门菌耐药特征及分子分型结果分析

林茂锐，周旋，李明友，黄基伟，刘桂治，曹东林

目的分析广东省第二人民医院2012-2014年临床常见沙门菌耐药特性及分子分型特征。方法对分离的84株沙门菌进行血清分型、药物敏感试验。选取不同菌株来源、血清型和耐药谱的51株沙门菌，按照美国PulseNet标准进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型。应用BioNumerics软件对电泳图谱进行分析，确定菌株间的相关性。结果84株菌分为20种血清型，沙门菌前3位血清型构成比从高到低分别为：鼠伤寒沙门菌占42.86%(36/84)、肠炎沙门菌占15.48%(13/84)、斯坦利沙门菌占8.33%(7/84)。本次分离沙门菌对头孢类抗生素敏感率达84.21%以上，对于环丙沙星与氯霉素的敏感性在66.67%以上，对于甲氧苄啶与庆大霉素的敏感性在50.88%以上，但仍存在多株多重耐药现象。51株沙门菌经过聚类分析可分为 42个PFGE型，表现为较大的遗传多样性。结论临床治疗时，应根据药敏试验结果指导临床，合理使用抗生素，以提高治疗效果。沙门菌耐药谱与 PFGE分型无明显关联。

沙门菌；耐药性；脉冲场凝胶电泳

Supported by the Guangdong Province Medical Science and Technology Research Fund (No.C2012036) and 2013 Annual Guangdong Provincial Finance Technology Development and Application of Special Fund Project (No.Guangdong[2013]401)

沙门氏菌是一种人兽共患的肠道病原菌，至今已有2 523种血清型被发现[1]。据世界卫生组织报告，1985年以来，在世界范围内，由沙门氏菌引起的已确诊的人类患病人数呈上升趋势，在一些欧洲国家已增加5倍以上[2-3]。WHO对沙门菌感染十分重视，早在2000年就成立世界范围的全球沙门菌监测系统，广东省疾病预防控制中心(CDC)从 2007年起加入全球沙门菌监测系统，全方位监测本地区临床常见菌株类型的分布与传播，及其对常用抗菌药物的敏感程度。我院作为广东省疾病预防控制中心的监测哨点医院，共监测了3 200余人次。我们收集分析了本院2012年到2014年检测出的84株沙门菌的菌株，进行耐药性分析和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型，为临床合理使用抗生素，提高治疗效果，控制耐药菌株产生提供实验依据。

1　材料与方法

1.1标本来源按照广东省CDC沙门菌监测对象标准，选择24 h内连续腹泻3次及以上，且粪便性状异常者；或出现发热，体温38 ℃以上，伴有头痛、寒战、全身乏力等症状者；或出现呕吐、腹泻、腹痛，粪便性状异常者，可为稀便、水样便、黏液便、脓血便及血便。凡符合以上两条及以上者，为标本留取对象。2012年1月至2014年12月广东省第二人民医院门诊及住院患者粪便标本中分离出沙门菌84株。

1.2试剂和仪器血琼脂平板由梅里埃(上海)生物制品有限公司提供,SBG(磺胺增菌肉汤)、XLD(木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐)培养基和沙门氏菌显色培养基由广州迪景微生物科技有限公司提供，沙门菌属血清诊断试剂盒购自宁波天润生物药业有限公司，美国BD公司Phoenix100全自动细菌鉴定药敏仪及配套试剂。Seakem Gold琼脂糖购自美国Cambrex公司；XbaⅠ酶购自美国Promega公司；CHEF Mapper脉冲场电泳仪和美国Bio-Rad公司Gel Doc EQ凝胶成像系统；Dade Microscan浊度仪购自美国Dade Behring公司。

1.3分离培养及鉴定采集新鲜粪便标本，保存于Cary-Blair运送培养基中并送至实验室，接种于SBG磺胺增菌肉汤，37 ℃培养过夜，转种于XLD和沙门菌显色培养基，继续37 ℃培养过夜。挑取可疑菌落用血清凝集法做初步生化鉴定，结果符合者送广东省CDC，复核APl20E生化鉴定及血清分型。

1.4药物敏感试验挑取初步生化鉴定符合单菌落，按照美国BD公司Phoenix100全自动细菌鉴定药敏仪操作规程对菌落进行药敏鉴定。结果判定参照美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute．CLSI)出版的药物敏感试验指南(2012版)。

1.5PFGE实验参照美国PulseNet的沙门菌PFGE的标准操作方法，见文献。

1.6统计学分析应用BioNumerics 4.0软件处理电泳图像，聚类分析选择组间非加权的几何平均数(unweighted pair group method using arithmetic averages，UPGMA)方法，采用基于条带比较的Dice系数衡量PFGE带型之间的相似度，相似度为100%者视为同一PFGE型。

2　结　果

2.1检测情况在收集检测的84份沙门菌株中，男女比例差别不大(1.1∶1)，而在季节分布上以每年的7—10月份为高发期(见图1)，人群年龄分布上以5岁以下婴幼儿为主，占67.86%(57/84)，其次中老年人群比例稍高，大于50岁人群比例为14.29%(12/84)。

图1　2012—2014年各月份沙门菌检出率Fig.1　Detection rate of Salmonella in different month in 2012—2014

2.2血清分型结果对所有沙门菌进行血清分型，84株菌分为20种血清型。沙门菌前3位血清型构成比从高到低分别为：鼠伤寒沙门菌占42.86%(36/84)、肠炎沙门菌占15.48%(13/84)、斯坦利沙门菌占8.33%(7/84)。另外罗森沙门菌、韦太夫雷登沙门菌分别为8.33%(7/84)和4.76%(4/84)，见表1。

2.3药敏试验结果本次分离沙门菌对头孢类抗生素(头孢他啶、头孢吡肟和头孢噻肟)敏感率达84.21%以上。对于环丙沙星与氯霉素的敏感性在66.67%以上，对于甲氧苄啶与庆大霉素的敏感性50.88%以上。对于ACSSuT耐药谱中的几种抗生素，出现氨苄西林(AMP)、链霉素(STR)、磺胺甲二唑(SMX)和四环素(TCY)多重耐药，耐药率在50%～75%之间，而其中的氯霉素(CHL)仍然相对敏感，但仍有6株鼠伤寒沙门菌出现ACSSuT耐药谱；有l株肠炎沙门菌13ESS1295和1株韦太夫雷登沙门菌14ESS1286对10种抗生素均耐药，1种中介。各年龄段的耐药率并没有出现大的差异， 见表2。

表1不同血清型沙门菌的所占百分比

Tab.1Percentage of different Salmonella serotypes

血清型(Serotype)菌株量(No.ofstrains)百分比(Ratio/%)鼠伤寒沙门菌(Typhimurium)3642.86肠炎沙门菌(Enteritidis)1315.48斯坦利沙门菌(Stanley)78.33罗森沙门菌(Rissen)78.33韦太夫雷登沙门菌(Weltevreden)44.76德尔卑沙门菌(Derby)22.38伦敦沙门菌(London)22.38猪霍乱沙门菌(Choleraesuis)11.19伤寒沙门菌(Typhi)11.19恩戈尔沙门菌(Ngor)11.19吉韦沙门菌(Give)11.19雷丁沙门菌(Rding)11.19里定沙门菌(Reading)11.19利奇菲尔德沙门菌(litchfield)11.19比斯拉沙门菌(Bsilla)11.19纽波特沙门菌(Newport)11.19圣保罗沙门菌(Saintpaul)11.19汤卜逊沙门菌(Thompson)11.19新斯托夫沙门菌(Sinstorf)11.19印第安纳沙门菌(Indiana)11.19

2.4PFGE试验结果选取分离的鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、斯坦利沙门菌种共51株分离株使用限制性内切酶XbaⅠ酶切、PFGE 分型并对电泳结果进行图谱聚类分型(图2)。根据菌株间相似性>100%视为同一PFGE型，51株沙门菌经过聚类分析可分为 42个PFGE型，相似度在53%～100%之间。其中32株鼠伤寒沙门菌可分为28个PFGE型，12株肠炎沙门菌可分为10个PFGE型，7株斯坦利沙门菌可分为5个PFGE型。鼠伤寒沙门菌中有3株2012年的菌株PFGE带型相似性为100%，3株2014年的菌株PFGE带型相似性为100%；肠炎沙门菌中2012年的ESS12451菌株与2013年的13ESS1294PFGE带型相似性为100%，2014年的2株菌株PFGE带型相似性为100%。斯坦利沙门菌的2012年的ESS12828株与2014年的14ESS0992株相似性为100%；2014年的2株菌株PFGE带型相似性为100%。

3　讨　论

据资料统计，在我国细菌性食物中毒中，70%～80%是由沙门氏菌引起[4]，人们一旦摄入了含有大量沙门氏菌(105～106个/g)的食物，就会引起细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒[4]。广州市属于亚热带气候，全年7—10月均较为炎热，有利于沙门菌的增殖，故这几个月的分离率明显高于其他月份。从菌种来源人群的年龄结构来看，5岁以下婴幼儿构成比明显高于成人，这与婴幼儿免疫力低下，感染该菌后病情表现严重，大多家长均会快速寻求医治，而当医生收治婴儿病患时，常做粪便培养有关。而老年人患病率仅次于婴幼儿也与其免疫力低下有关。本次分离的沙门菌血清型以鼠伤寒沙门菌为主，其次为肠炎沙门菌和斯坦利沙门菌。该分布与广东省历年整体分布保持一致[5-8]，但与中山市的斯坦利沙门菌所占比例高于肠炎沙门菌有区别[9]。

表284株沙门菌不同年龄段药物敏感试验结果(%)

Tab.2Antibiotic susceptibility of 84 Salmonella stains in different age groups

age(stain)≤5(57/84)6-20(3/84)20-50(12/84)≥50(12/84)SIRSIRSIRSIRAMP29.820.0070.1833.330.0066.6750.000.0050.0033.330.0066.67CAZ84.213.5112.28100.000.000.0091.678.330.0091.678.330.00CIP71.9317.5410.5366.670.0033.3375.0016.678.3383.3316.670.00CHL68.421.7529.8233.330.0066.6758.3316.6725.0066.678.3325.00CTX84.210.0015.7966.670.0033.33100.000.000.0091.670.008.33FEP87.721.7510.53100.000.000.0091.670.008.3391.670.008.33NAL49.1214.0436.8433.3333.3333.3358.330.0041.6741.670.0058.33SMX24.561.7573.680.000.00100.0016.678.3375.0050.000.0050.00STR19.3022.8157.890.0066.6733.338.3333.3358.3333.3325.0041.67TCY22.811.7575.4433.330.0066.6725.000.0075.0041.678.3350.00TMP54.391.7543.8633.330.0066.6741.670.0058.3366.670.0033.33GEN50.8815.7933.3366.670.0033.3366.670.0033.3358.338.3333.33

注：氨苄西林(AMP)、头孢他啶(CAZ)、环丙沙星(CIP)、氯霉素(CHL)、头孢噻肟(CTX)、头孢毗肟(FEP)、萘啶酸(NAL)、磺胺甲二唑(SMX)、链霉素(STR)、四环素(TCY)和甲氧苄啶(TMP)庆大霉素(GEN).

S：敏感(Susceptible) I：中介(Intermediate)R：耐药(Resistant)

图2　51株沙门菌PFGE聚类分析图谱(XbaⅠ内切酶)Fig.2　Cluster analysis of 51 stains of Salmonella according to the results of PFGE incised by XbaⅠ

在本次耐药率分析中出现6株鼠伤寒沙门菌存在ACSSuT耐药谱；有l株肠炎沙门菌13ESS1295和1株韦太夫雷登沙门菌14ESS1286对10种抗生素均耐药，1种中介。对AMP的耐药率相较于往年[5]有大幅上升，达到66%以上。对头孢毗肟(FEP)的敏感率也下降到90%左右。提示本地区引起腹泻的沙门菌耐药性变得更加严峻，这与世界范围的沙门菌耐药趋势相同[10]，需要临床医生的重视，在早期经验性用药的基础上，根据药敏结果合理使用抗生素。

近年来，随着基因测序技术的快速发展，对各种流行菌株监测的方法逐步发生改变，然而PFGE分型技术仍被广泛地应用于我国各级别疾控中心对细菌的分子流行病学研究，其优点具有能够对整个染色体进行分析、重复性好、易于标准化等[11]。在本次研究中，51株沙门菌经过聚类分析可分为42个PFGE型，相似度在53%～100%之间，表现为较大的遗传多样性。对于相似度100%的菌株溯源及病例分析，并没有同源性暴发的证据，且这些菌株的耐药谱并不存在明显关联性，这可能是由于菌株耐药基因发生突变位点并不在以XbaⅠ为酶切基础的PFGE 酶切位点上，导致耐药情况无法从分型中表现出来。

对PFGE结果的分析，不同研究者可出现较大差异。Tenover等在解释PFGE结果时，将具有85%以上相同条带的菌株认为是相同的菌株，50%以上的条带不相同时，菌株被认为流行病学不相关。这是因为细菌存在高度变异性，他们认为在判断是否同一菌株时允许存在一定的变异[12]。这一观点在现在的一些畜牧业食源性肉类研究中被使用[11]。因此，在基因技术高速发展的背景下，更加精确标准化的溯源监测方案亟待完善。

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Characterization of antimicrobial resistances and molecular characteristics of 84 strains ofSalmonella

LIN Mao-rui，ZHOU Xuan，LI Ming-you，HUANG Ji-wei，LIU Gui-zhi，CAO Dong-lin

(Departmentoflaboratory,thesecondPeoplesHospitalofGuangdong,Gungzhou510317,China)

A total of 84Salmonellaisolates，from part of Guangzhou，2012-2014，were detected with serum agglutination and antibiotic susceptibility to investigate the antimicrobial resistance. Results were assessed by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI，2012). The 51Salmonellastrains were tested by pulse field gel electrophoresis (PFGE). Bionumerics software was used to analyze the PFGE results in order to determine the correlation between differentSalmonellastrains. Results showed thatSalmonellainfections were found in all age groups and children under 5 years old accounted for the major proportion (67.86%)，with the gender ratio at 1.1∶1. A total of 84Salmonellastrains were divided into 20 serotypes. The top three wereSalmonellatyphimurium(42.86%)，Salmonellaenteritidis(15.48%) andSalmonellastanley(8.33%). Over 84.21% ofSalmonellawere sensitive to Cephalosporin，66.67% to Ciprofloxacin (CIP) and Chloramphenicol (CHL)，50.88% to Trimethoprim (TMP) and Gentamicin (GEN). However，there still were many strains showed multidrug resistance. The 51Salmonellastrains were divided into 42 PFGE types，showing great genetic diversity. We emphasized that antibiotics should be chosen reasonably and prudently based on antimicobial sensitivity testing. There is no significant correlation betweenSalmonellaresistance patterns and PFGE types in our survey.

Salmonella; antimicrobial resistance; pulsed-field gel electrophoresis

Cao Dong-lin，Email: caodl@126.com

曹东林，Email：caodl@126.com

广东省第二人民医院检验科，广州510317

R378.2

A

1002-2694(2016)06-0553-05

2015-08-13；

2015-12-22

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.009

广东省医学科学技术研究基金(No.C2012036)和2013年度广东省级财政技术研究开发与推广应用专项资金(粤财工[2013]401号)联合资助