鄯科明，滕中秋



膜电喷雾质谱法快速检测细菌氨基糖苷耐药性

鄯科明1，滕中秋2,3,4

目的针对细菌耐药性的产生和传播已成为全球重要公共卫生问题的现状，拟建立细菌氨基糖苷耐药性的快速检测方法。方法基于膜电喷雾质谱法，以ArmA蛋白的特异性肽段TYDVVFLLK (TK-9)特征性母子离子对为检测目标，建立了细菌氨基糖苷耐药性的快速检测方法。结果采用合成的标准肽段用于建立和验证定性定量检测方法学。由于膜电喷雾离子化技术可大幅度提高质谱检测灵敏度，使得检测流程仅需进行2 h增菌，与微波酶解法配合运用可最大程度缩短样本前处理流程。结论经验证该方法可成功检测模拟真实环境样本中细菌氨基糖苷耐药性，具有极高的检测灵敏度和准确度。在今后的研究中有望将该方法用于对环境样本中其它细菌耐药蛋白的快速检测。

膜电喷雾离子化；快速检测；细菌耐药；ArmA

Rapid detection of bacterial aminoglycoside resistance using membrane electrospray ionization mass spectrometry

Supported by the Natural Science Foundation of China (No.81471919) and the Research Foundation of China CDC (No.2014A101).

细菌耐药性的产生和传播已成为全球重要的公共卫生问题[1]。细菌依靠可移动元件如插入序列、质粒和“耐药基因组岛”等可快速获得抗生素耐药性[2]。目前，虽有超过15种针对细菌不同生理或代谢功能而设计的抗生素得到广泛应用，但是在细菌的各种耐药机制面前他们无一幸免[3]。面对每种抗生素，细菌都随之进化出了应对策略，而其中的耐药机制则与一系列的耐药基因有关。例如细菌获得qnrA/B/S基因则对氟喹诺酮类抗生素产生耐药性[3-4]，获得blaCTX-M和blaNDM-1基因则对β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素产生耐药性[5-7]，具有mcr-1则耐多黏菌素抗生素[8]，具有armA则耐氨基糖苷类抗生素等等[9-10]。为防止不当和过度使用抗生素，对细菌耐药性进行定性、定量检测成为迫切需求[11]。

用于对细菌耐药性的检测方法已有一些相关报道。例如，常规微生物学研究中经常采用琼脂稀释法对细菌药物敏感性进行测试[12-13]；聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR对耐药基因的检测[11,14]；此外近年来也有报道采用质谱(MS)法对β-内酰胺类抗性的检测[15-16]。质谱具有很高的灵敏度和特异性，是十分强大的分析工具。特别是近年来敞开式电离技术(ambient ionization)的不断发展，使复杂的样本前处理过程得以大大缩短，让快速检测痕量复杂样本成为可能。已报道的敞开式电离技术包括：解析电喷雾电离(DESI)[17]，实时直接分析质谱(DART)[18]，纸喷雾电离(PS)[19-20]和膜电喷雾电离(MESI)[21]等等。

本文基于膜电喷雾质谱法，以ArmA蛋白的特异性肽段TYDVVFLLK (TK-9)的特征性母子离子对为检测目标，建立了细菌高水平氨基糖苷耐药性的快速检测方法。这一方法在未来有望被继续拓展，用于细菌其它耐药基因表达蛋白的检测。

1　材料与方法

1.1材料与试剂菌株信息详见表1。脑心浸液培养基购于北京陆桥技术有限责任公司(中国北京)；尿素、硫脲、CHAPS、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、 NH4HCO3, KH2PO4和K2HPO4购于Sigma-Aldrich公司(美国)；测序级胰蛋白酶购于Promega公司(美国)；色谱级甲酸(FA)、甲醇 (MeOH)购于Fisher Scientific (美国)；蛋白浓度检测试剂盒(#500-0204)购于Bio-Rad公司(中国上海)；纯水购于娃哈哈集团(中国杭州)；滤纸购于国药集团化学试剂北京有限公司(中国北京)；透析膜(截留分子量3.5 kDa和8-14 kDa)购于伯易生物科技有限公司(中国上海)；合成肽段TYDVVFLLK (TK-9，经MALDI-TOF MS及HPLC验证，纯度> 95%)购于Pepmic公司(中国苏州)。

表1本文涉及的菌株信息

Tab.1Bacteria information used in this study

序号Entry细菌(菌株号)Bacteria(Straincode)armA基因armAgene来源Source1鲍曼不动杆菌(MDR-ZJ06)A.baumannii(MDR-ZJ06)+医院来源(中国北京)HospitalinBeijing,China2鲍曼不动杆菌(Ab-1)A.baumannii(Ab-1)-医院来源(中国北京)HospitalinBeijing,China3大肠杆菌(A839)E.coli(A839)+医院来源(中国北京)HospitalinBeijing,China4大肠杆菌(BL21)E.coli(BL21)-宝生物科技有限公司(中国大连)TakaraBiotechCo.Ltd.inDalian,China

1.2细菌培养细菌菌株在脑心浸液(BHI)肉汤中37 ℃持续振荡培养。新鲜BHI肉汤接种了1∶1 000稀释的指数期培养(OD600=0.6)的菌株。初始培养浓度大约为1×106CFU/mL，记录下OD600，并且提取不同培养时间的蛋白。

1.3PCR检测菌株armA基因分离株通过PCR方法来确认携带armA基因，包含引物ArmA-F: 5′-ATGGATAAGAATGATGTTGTT-3′和ArmA-R: 5′-TTTCTGAAATCCACGAGTAATA-3′。扩增程序包含以下过程的30个循环，每个过程为：95 ℃ (30 s)，55 ℃ (30 s)，72 ℃ (45 s)，72 ℃ (8 min的延伸期)。PCR的扩增产物(774 bp)，通过琼脂糖凝胶电泳检测并通过ABI PRISM 3730XL测序仪(中国北京)测序验证。

1.4样本制备细菌细胞的细胞质蛋白由裂解液超声波提取(裂解液含：7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲， 4 % CHAPS和1 % DTT)。裂解后的悬浊液于16 000 g离心15 min后取上清，采用Bradford法测定蛋白浓度。使用微波法进行蛋白酶切，即：蛋白样品在50 μL的50 mmol/L碳酸氢铵溶液中溶解并且加入5 mmol/L DTT在95 ℃反应5 min，随后在15 mmol/L的IAA存在下在黑暗处反应30 min。最后使用测序级胰酶按照酶/底物1∶50 (w/w)的比例加入胰蛋白酶，在700 W的微波下酶切15 min。

1.5膜电喷雾电离质谱法(MESI-MS)分析MESI-MS分析使用Bruker HCT质谱仪(德国)。干燥气为氮气(流速10 L/min; 温度150 ℃)；采用正离子模式；毛细管电压为-1.5 kV。膜电喷雾电离装置(MESI)如图1所示：将双层透析膜(约7 mm等边三角形)压实于已润湿的滤纸上，两层透析膜具有不同的截留分子量，其中第一层透析膜的截留分子量为8～14 kDa, 第二层为3.5 kDa。透析膜和滤纸一并用铜夹固定于距质谱进样口约5 mm的位置。样本检测过程全部为上样2 μL样本溶液至透析膜中间，等待30 s后移除第一层透析膜，在第二层透析膜后端施加3 kV电压，同时在膜上加入8 μL冲洗溶剂(MeOH∶H2O∶FA=60∶40∶0.1, v/v)，在电压推动下样本逐渐向前移动，在三角形透析膜尖端形成喷雾，进行质谱检测。

图1　膜电喷雾离子源装置的结构示意图Fig.1　Instrumental setup of MESI-MS ion source

2　结　果

2.1ArmA蛋白特异性肽段的选择特异性肽段从细菌耐药蛋白ArmA的理论酶切肽段通过在Exapasy (http://web.expasy.org/peptide_mass/)检索获得。采用BLAST算法验证理论酶切肽段在细菌中没有同源性。特异性肽段的选择需遵循以下几个原则：1)是ArmA蛋白特有的；2)有很高的质谱强度和离子化效率；3)无不稳定的氨基酸和胰蛋白酶漏切位点。最终本文筛选确定肽段TYDVVFLLK (TK-9)进行合成，用于下一步实验。

2.2膜电喷雾电离电压的优化在实验中需要对膜电喷雾直流电压的选择进行优化。分别尝试了不同电压范围(1～3 kV)条件下对MESI-MS响应的影响。当电压低于1 kV时，难以形成喷雾；而当电压高于3 kV时容易在空气中产生放电，无法形成稳定而有效的喷雾。最终经过实验优化，我们选择了3 kV电压作为后续的实验条件。

2.3MESI-MS检测ArmA特异性肽段采用PCR方法确认菌株是否携带armA基因(图2)。图3记录了菌株的生长曲线上各时间点的菌体总蛋白浓度。根据目标肽段的最低检出限(LOD)和提取蛋白的浓度，可推测增菌所需的最短时间。在本发明涉及的示例菌株中，2 h增菌即可产生足够量的ArmA用于MEIS-MS/MS检测。不同的菌株产生蛋白的能力不同，所以对不同的菌，最少培养时间也可能不同。不排除后续检测菌株增菌时长低于2 h的情况。图4A为合成标准ArmA特异性肽段(1 mmol/L)的MESI-MS/MS分析。肽段TK-9的特征性母子离子对为m/z549.2→833.2。

图2　PCR方法验证菌株携带/不携带armA基因Fig.2　Bacteria strains with/without armA gene verified by PCR assay

图3　细菌分离株增菌不同时间时的蛋白浓度Fig.3　Protein concentration determination of bacteria strains after different cultural time

MESI-MS使得质谱快速分析具有显著去除基质效应的能力，固而在本方法中脱盐步骤可省略，从而缩短了检测时间。将特异性肽段作为检测目标，间接检测ArmA而非直接检测ArmA本身，使得可以巧妙的运用MESI-MS的透析膜去除样本中干扰分析的因素。其中，样品体系内残余的胰蛋白酶可通过第一层透析膜除去(MWCO 8-14 kDa)。在胰蛋白酶消化过程中引入的盐和其他小分子可通过第二层透析膜(MWCO 3.5 kDa)除去。

2.4方法学验证本文从不携带armA基因的菌株(Ab-1 and BL21)中提取所得蛋白的酶切肽段作为空白基质，用以考察添加该空白基质合成肽段的标准曲线线性度，最低检出限(LOD, S/N=5)和最低定量限(LOQ, S/N=15)。通过MESI-MS检测一些列浓度梯度肽段TK-9的特征性母子离子对，可知其：线性回归方程为y=0.287 9 x+4.076 8；相关系数(r2)为0.993 8；线性范围为1～1000 fmol·μL-1；LOD为1 fmol·μL-1；LOQ为2 fmol·μL-1。采用质控样本(浓度分别为10和50 fmol·μL-1的合成肽段)考察方法精密度、准确度和回收率(如表2所示)。通过检测高低不同浓度的特异性肽段，验证了方法学具有较好的精密度、准确度及回收率。

表2MESI-MS分析的方法学验证 (n=5)

Tab.2Methodology validation of MESI-MS analysis (n=5)

质控样本QCsample质控样本浓度ConcentrationofQCsample(fmol·μL-1)精密度Precision(RSD%)准确度Accuracy(RE%)回收率Recovery(%,x±s)肽段TK-9100.571.2995.08±1.12PeptideTK-9500.351.1793.73±0.88

3　模拟环境样品的快速测定

真实卫生环境检测采用在实验室通过拭子法从表面获得的环境样本[22]，向其中添加有鲍曼不动杆菌(MDR-ZJ06 and Ab-1)以及大肠杆菌(A839 and BL21)。经过2 h的增菌培养胰酶消化后，采用上述建立的MESI-MS/MS方法，成功识别到模拟环境样品中的肽段TK-9 (如图4B所示)，而阴性对照样本检测不到TK-9的存在。由此可见，本文所建立的新方法整体检测流程在3 h内可完成，对添加了携带或不携带armA基因的不同种细菌(鲍曼不动杆菌、大肠杆菌)的模拟环境样本进行检测，实现了具有高灵敏度与准确度的快速检测。

A. 合成标准肽段； B. 模拟真实样本

4　结　论

综上述所，本文采用膜电喷雾质谱法对ArmA特异性肽段TK-9的特征性母子离子对的检测，建立了对细菌携带氨基糖苷耐药基因表达蛋白ArmA的快速检测方法。这一新方法具有快速检测的特点，所需的增菌、胰酶消化及质谱检测整体流程可在3 h内完成对细菌氨基糖苷耐药性的检测，经验证该方法具有较高的灵敏度、精密度和准确度。

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SHAN Ke-ming1, TENG Zhong-qiu2,3,4

(1.PlanningandResearchInstitute,NorincoGroup,Beijing100053,China;2.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;3.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,Beijing102206,China;4.CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,

Hangzhou310003,China)

Antibiotic resistance in pathogenic bacteria is becoming a global public health problem, such as aminoglycoside resistance encoded byarmAgene. Rapid analysis of environmental samples is still challenging although many methods reported,A rapid analytical method was developed to identify bacterial high-level aminoglycoside resistance by using membrane electrospray ionization mass spectrometry (MESI-MS) in this study. The precursor/production pair of peptide TYDVVFLLK (TK-9) unique to ArmA was detected as the target analyte. Synthesized standard peptide was used for developing and validating the methodology. MESI-MS with two layers of membrane offers high sensitivity so that only 2 hours was needed for bacterial culture. The novel assay offered a rapid method to determine bacterial aminoglycoside resistance with high sensitivity, accuracy and precision in simulated environmental samples within 3 hours. This method could also be applied to identify other drug-resistance protein in clinical/environmental samples.

membrane electrospray ionization; rapid analysis; drug-resistance; ArmA

Teng Zhong-qiu, Email: tengzhongqiu@icdc.cn

滕中秋，Email: tengzhongqiu@icdc.cn

1.中国兵器工业规划研究院，北京100053；2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京102206；3.传染病预防控制国家重点实验室，北京102206；4.感染性疾病诊治协同创新中心，杭州310003

R378

A

1002-2694(2016)06-0564-05

2016-02-14；

2016-04-22

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.011

国家自然科学基金面上项目(No. 81471919)和中国疾病预防控制中心青年科研基金 (No. 2014A101)联合资助