王　剑，郭晓芳，鲍建忠，董学书，孙晓东，林祖锐，姜进勇，周红宁



云南楚雄2014年蚊媒及其病毒感染调查

王剑1，郭晓芳1，鲍建忠2，董学书1，孙晓东1，林祖锐1，姜进勇1，周红宁1

目的了解云南楚雄元谋、武定和双柏3县蚊虫及其主要虫媒病毒种类，为制定出有效的虫媒传染病防控对策提供依据。方法2014年6-7月采用诱蚊灯在调查点通宵捕捉蚊虫，对现场采集蚊虫进行形态分类鉴定；采用C6/36细胞培养法和RT-PCR扩增目的基因片段对蚊虫体内病毒进行分离、鉴定。结果共捕获4属15种12 384只蚊虫，三带喙库蚊、中华按蚊、致倦库蚊和微小按蚊分别占捕获蚊虫总数的59.95%、19.31%、10.90%和 4.13%;C6/36细胞培养处理116组蚊虫，其中29组发生细胞病变，经基因鉴定为版纳病毒(BAV)、Totivirus 病毒(TOV)、乙型脑炎病毒(JEV)和Nam Dinh病毒(NDiV)4种，其中，三带喙库蚊的JEV、BAV、TOV和NDiV基因扩增批阳性率分别为1.87%、11.32%、3.77%和9.43%;希氏库蚊的NDiV基因扩增批阳性率为25.00%;致倦库蚊和中华按蚊的BAV、NDiV批阳性率分别为20.00%、33.34% 和5.00%、7.50%。结论楚雄地区蚊虫种类多，且以三带喙库蚊和中华按蚊为优势蚊种，从两种蚊虫标本中能分离到JEV、TOV、BAV和NDiV病毒，表明调查地区发生乙脑及其它虫媒病毒性疾病流行的危险较大。

云南楚雄；蚊虫；虫媒病毒；病毒分离；基因鉴定

楚雄州地处云南中部，北与四川接壤，气候属亚热带季风气候。虫媒病毒(Arborvirus)是指在节肢动物如蚊虫、白岭、蠓虫等体内繁殖,并通过上述吸血动物叮咬将病毒传播给人或畜引起后者感染的病毒[1-2]。该病毒全球目前共发现14科535种,其中，与人兽传染病密切相关的虫媒病毒主要有7科11属135种。虫媒病毒的传播媒介为吸血节肢动物(主要为蚊和蜱)，属于人类健康危害最大的医学昆虫。为了解楚雄州虫媒分布和蚊虫自然感染虫媒病毒的情况，我们进行了虫媒种群、病毒分离和鉴定的调查。

1　材料与方法

1.1现场调查点的选择调查点选择在楚雄州元谋县、武定县和双柏县。根据不同纬度、经度和海拔,在每县选取2个调查点，调查点要求周围有森林、溪流稻田等利于蚊虫滋生的环境，居民区饲养牛、猪等牲畜。

1.2蚊虫采集方法及标本处理在每个现场调查点分别选择人房和猪、牛等牲畜房挂灯诱捕，采用夜间诱蚊灯法通宵捕蚊：于20∶00时至次日8∶00通宵诱蚊灯(功夫小帅牌UV 光催化捕蚊器，220 VP50 Hz,24 W,武汉吉星环保科技有限责任公司出品)捕蚊，连续2 d。次日收回的集蚊装置放置于-20 ℃冰箱，待蚊虫冻死后，采用解剖镜通过形态学方法鉴定蚊虫种类，并进行记录。鉴定后的蚊虫按照种类放置于1.8 mL冻存管内(每管不超过50只)，做好标记后放入液氮中保存，待实验室病毒分离鉴定。

1.3蚊虫病毒自然带毒检测对上述采集并储存在液氮中的蚊虫标本，进行病毒分离与鉴定。

1.3.1主要试剂TRPMI1640培养基,购自Gibco；小牛血清,购自杭州四季青生物制品公司； QIAamp Viral RNA mini kit,购自QIAGEN；M-mlv-RT逆转录酶、Go Taq Green Master Mix,购自Promega；RNA酶抑制剂、dNTP Mixture(10mM dNTP)、Random Primer(9mer)随机引物及DL2000 DNA Marker,购自Takara；琼脂糖,购自Invitrogen；GoldView：购自TIANGEN。

1.3.2主要仪器生物安全柜,购自NUAIR-NU-440-400E；倒置显微镜,购自Nikon-ECLIPSE TE2000-S；二氧化碳孵箱,购自Thermo 3111；台式冷冻离心机,购自SIGMA 3K15；PCR扩增仪,购自BIO-RADiQTM 5。

1.3.3病毒分离

1.3.3.1蚊虫标本的处理将装有蚊虫的冻存管从液氮罐中取出后，随机将50只蚊虫计为1组置于预冷的无菌乳钵中，加入1.5 mL标本处理液将蚊虫标本反复研磨至无较大组织碎片后，全部移入2 mL冻存管中，置于-80 ℃保存。取蚊悬液250 μL于4 ℃12 000 r/min离心，取上清用于接种细胞。

1.3.3.2细胞传代将C6/36细胞弃去培养液，加入3 mL生长液(10%FBS 1640)，反复吹打细胞生长面，将细胞生长面吹下并分散细胞。按1∶4的比例传代后，28 ℃培养。

1.3.3.3蚊虫标本病毒分离将C6/36细胞接种于24孔细胞培养板并长成单层后，吸弃生长液，接种蚊悬液上清0.1 mL/孔，于32 ℃吸附1 h，每个细胞培养板均设有2孔C6/36细胞对照。吸弃蚊悬液后，补加1 mL维持液(2% FBS 1640)，置于32 ℃静置培养，逐日观察细胞病变(CPE)。于第7 d收细胞冻存于-40 ℃。再取冻融1次的细胞悬液0.1 mL，进行传代，按上述方法观察和保存。对所有标本均盲传3代。

1.3.4病毒鉴定

1.3.4.1蚊虫RNA提取随机将每种蚊种以50只蚊虫计为1组参照试剂盒说明提取蚊虫RNA。将310 μg的carrier RNA溶解在310 μL AVE缓冲液中，使其终浓度为1 g/L。每个1.5 mL EP管中，加入560 μL AVL和5.6 μL含carrier RNA的AVE后，加入140 μL病毒分离液上清，并用移液器混匀15 s，室温放置10 min(15～25 ℃)。上述样品中加560 μL无水乙醇，轻柔混匀15 s。将该液体分2次加入QIAamp柱子中(630 μL/次)，8 000 r/min离心1 min，弃废液。加入500 μL AW1洗柱，8 000 r/min离心1 min，弃废液。加入500 μL AW2洗柱，13 000 r/min离心3 min，弃废液。原管离心13 000 r/min，1 min，甩干柱子。将柱子置于一个新1.5 mL EP管中，加40 μL AVE，室温放置1 min。离心8 000 r/min，1 min，收集洗脱后的RNA，立即进行后续试验或存于-80 ℃冰箱。

1.3.4.2引物设计、合成与PCR扩增针对云南分离到的7个病毒科(包括Toti病毒)基因组设计、合成特异引物(见表1)。

1.3.4.3RT-PCR将1 μL随机引物以及15 μL RNA模板混匀离心后，70 ℃水浴5 min，冰浴5 min。再加入5×反应缓冲液5 μL、10 mmol dNTP、RNasin40 μ/μL和M-MLV(200 μ/μL)25 μL混合液，混匀离心后，42 ℃、60 min，95 ℃、10 min，-20 ℃保存。PCR反应体系(25 μL体系)，上、下游引物(10 μmol)各1 μL，GoTaq Green Master Mix2x缓冲液 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA 2 μL，扩增条件(见表1)。

1.4数据分析将数据录入excel 表并进行构成比计算，批阳性率、总批阳性率计算公式如下：

批阳性率=(某种蚊虫某县阳性组数/某种蚊虫某县所有组数)×100%

总批阳性率=(某种蚊虫3县阳性组数/某种蚊虫3县所有组数)×100%

表1云南常见蚊虫传播病毒的PCR扩增引物和反应条件

Tab.1PCR amplified primers and reaction conditions for identification of viruses from common mosquito in Yunnan Province

病毒科Viraceae病毒属(种)Potyvirus扩增位置Amplificationlocation引物名称Primer引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')扩增长度/bpAmplifiedfragmentlength/bp反应条件Reactionconditions黄病毒科Flaviviridae黄病毒属FlavivirusNS5F1TACAACATGATGG-GAAAGAGAGAGAA26694℃,3min;94℃30s,52℃30s,72℃30s,35个循环;72℃10minF2GTGTCCCAGCCGGCGGT-GTCATCAGCNS5FU2GCTGATGACACCGCCG-GCTGGGACAC850cFD3AGCATGTCTTCCGTGGT-CATCCAJEVE蛋白EproteinJEV-EFJEV-ERAAGATGCCACTTCCA-CAYCTCAAGATGCCACTTCCA-CAYCTC1663披膜病毒科Togaviridae甲病毒属Alphavirus通用引物UniversalprimerM2wcMw3M2W2YAGAGCDTTTTCGCAY-STRGCHWACATRAANKGNGTNGTRT-CRAANCCDAYCCTGYCCNVTGMDNWSYVC-NGARGAYCC434(M2w和cMw3)310(M2W2和cMw3)94℃,3min;94℃30s,52℃/55℃*30s30s,72℃30s,35个循环;72℃10min呼肠孤病毒科ReoviridaeBAV第12片段12thfragments12-854-SAAATTGATAGYGYTTGCG-TAAGAGAC84512-B2-RGTTCTAAATTGGATACG-GCGTGC506LNNV第12片段12thfragmentsLNV12s1GGAAGAATCAATGCCG-TAGCCLNV12r1GTGACGATCTTCTCT-GAACCAGTG94℃,3min;94℃30s,55℃40s,72℃30s,35个循环;72℃10minKDV第12片段12thfragmentsKDV-12-FGACGCTTTGAGAT-TATCTCGAC354KDV-12-RGCTCAATCGCATTCTCACC表1(续)病毒科Viraceae病毒属(种)Potyvirus扩增位置Amplificationlocation引物名称Primer引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')扩增长度/bpAmplifiedfragmentlength/bp反应条件Reactionconditionskdv526RGGTGCCGAAGGATCAG-GCTTAC503kdv24FCAACGCTTTGAGATT-AGCTCGACYUOV7片段7fragmentsYUOVS7FAGCATTCGGTACGCAG-TATCTCG470YUOVS7RGCCGAGCCGATCATGT-CACGTGT

注：*为第2轮反应的温度

Note:* for the second round of reaction temperature.

2　结　果

2.1蚊虫组成共捕获4属15种12 384只蚊虫，包括库蚊属(GenusCulex)5种，按蚊属(GenusAnopheles)6种、骚扰蚊属(GenusOchlerotatus)2种和阿蚊属(GenusArmigeres)2种。其中三带喙库蚊(Cx.tritaeniorhynchus)7 424只，中华按蚊(An.sinensis)2 391只，致倦库蚊(Cx.pipiensquinquefasciatus)1 350只，微小按蚊(An.minimus)511只，希氏库蚊(Cx.theileri)355只，多斑按蚊(An.maculatus)104只，威氏按蚊(An.willmiri)56只，伪威氏按蚊(An.pseudowillmori)51只，骚扰阿蚊(Ar.subalbatus)35只，其它蚊种(每种<30只)共169只。三带喙库蚊、中华按蚊、致倦库蚊和微小按蚊分别占捕获蚊虫总数的59.95%、19.31%、10.90%和 4.13%，三带喙库蚊和中华按蚊为当地优势蚊种(见表2)。

表2楚雄3县诱蚊灯捕蚊法捕获蚊虫种类情况

Tab.2Composition and distribution of mosquitoes collected from residential areas of 3 counties of Chuxiong Prefecture by lamp-traps

虫种Mosquitospecies元谋县Yuanmou武定县Wuding双柏县Shuangbai合计Total数量Quantity(只)数量Quantity(只)数量Quantity(只)数量Quantity(只)百分比Percentage(%)三带喙库蚊Cx.tritaeniorhynchus19854589850742459.95中华按蚊An.sinensis6501052689239119.31致倦库蚊Cx.pipiensquinquefasciatus385655310135010.90微小按蚊An.minimus653251215114.13其他蚊种other1961084047085.71合计Total32816729237412384100.00

2.2蚊媒病毒分离共进行蚊虫病毒分离116组，其中29组有细胞病变，在培养7 d后的乙型脑炎病毒(JEV)E、版纳病毒(BAV)B、Totivirus 病毒(TOV)D、和Nam Dinh病毒(NDiV)C和培养7 d的对照细胞A比较分别呈现:细胞聚集和细胞融合、细胞脱落和细胞内有颗粒物、细胞脱落和细胞大小不等、细胞聚集和细胞胀大的变化 (见图1)。

A：细胞对照；B：BAV；C：Nam Dinh；D：Toti；E：JEV图1　BAV、NDiV、TOV、JEV4种病毒感染细胞的形态变化Fig.1　Morphological changes of infected cells by four kinds virus of BAV, NDiV, TOV, JEV

2.2.1病毒分离情况从29组细胞病变中共分离到4科，即黄病毒科、呼肠孤病毒科、Toti病毒科、Mesoniviridae 病毒科的4种病毒，分别为乙型脑炎病毒(JEV)、版纳病毒(BAV)、Totivirus 病毒(TOV)、和Nam Dinh病毒(NDiV)，其中3县同时检测到BAV和NDiV(见表3)。

表3楚雄3县蚊媒病毒分离情况

Tab.3Mosquito borne virus isolated from mosquitoes collected from residential areas of 3 counties of Chuxiong Prefecture

地区Region黄病毒科Flaviviridae呼肠孤病毒科ReoviridaeToti病毒科TotiViraceaeNamDinh病毒科NamDinhViraceae合计TotalJEVBAVTOVNDiV元谋县Yuanmou02013武定县Wuding1811020双柏县Shuangbai00156合计Total11021629

2.2.2病毒基因检测情况通过巢式PCR扩增，在三带喙库蚊、希氏库蚊、致倦库蚊和中华按蚊4种蚊虫检出4种病毒基因(见图2)。

图2　4种蚊媒中PCR扩增JEV、NDiV、TOV、BAV基因的电泳图Fig.2　Electrophoretogram of PCR amplification of JEV, NDiV, TOV and BAV genes from four mosquito vectors

其中，从三带喙库蚊中分离到4种病毒，从希氏库蚊分离到1种病毒，从致倦库蚊和中华按蚊分别分离到2种病毒。三带喙库蚊中JEV、BAV、TOV和NDiV基因扩增批阳性率分别为1.87%、11.32%、3.77%和9.43%,希氏库蚊的NDiV基因扩增批阳性率为25.00%，致倦库蚊的BAV和NDiV基因扩增批阳性率分别为20.00%和33.34%，中华按蚊的BAV和NDiV基因扩增批阳性率分别为5.00%和7.50%。

3　讨　论

1975年以来在滇西、滇西北、滇西南和滇南约50余个县开展了大量的蚊虫携带病毒状况调查，分离鉴定约5个病毒科5病毒属11种病毒321株病毒；在鉴定的11种病毒中包括辛德毕斯病毒(SINV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、盖塔病毒(GETV)、乙型脑炎病毒(JEV)、登革病毒(DENV)、云南新环状病毒(YUOV)、Colti病毒(Coltivirus)、Kadipiro病毒(KDV)、版纳病毒(BAV)、浓核病毒(DNV)和巴泰病毒(BATV)[3]。其中,在与云南金沙江中部楚雄相邻的大理州过去从蚊虫中仅分离出24株JEV，未发现其他病毒种类[4-7]；同时有研究报道在云南金沙江下游地区三带喙库蚊中分离出1株JEV和5株DNV病毒，及从中华按蚊中分离出2株DNV病毒[8]。而本次调查在楚雄3个县蚊虫中不仅发现了JEV病毒，而且还分离出了BAV、Toti病毒和Nam Dinh病毒。对于JEV，近10多年许多学者在滇西、滇西北、滇西南和滇南多个州(市)、十余种蚊虫中均分离到了上百株JEV病毒,也证实了三带喙库蚊属于这些地区乙型脑炎的主要媒介[3，9]。在楚雄，虽然未见从该州区域蚊虫中分离发现JEV的报道，但近几年JEV病例分析发现，该州JEV病例一直属于云南省JEV中度发病地区(发病率(1.5～3)/10万)[10]。而本次调查从当地优势蚊种三带喙库蚊中首次发现了JEV，为此对于该蚊或其他优势蚊种在楚雄州JEV流行病学特征的研究仍需开展进一步的研究，提示当地疾控部门应加强针对三带喙库蚊为主的防蚊灭蚊措施和宣教活动，以保护当地居民的健康。BAV病毒在云南的研究较多，早在1987年就首次从云南省西双版纳一名无名热及脑炎患者血清和脑脊液中分离到发现，此后相继从滇东、滇西南、滇西北地区三带喙库蚊、中华按蚊等蚊虫中分离到版纳病毒[11-15]。本次在楚雄元谋和武定调查中也均发现了大量的版纳病毒(10株)，该病毒是否已经在云南流行及其该病毒引起的疾病传播规律或致病机制等问题还有待深入研究。至于Toti病毒和Nam Dinh病毒，因不能在哺乳动物细胞内繁殖，对人的致病性未知，由此对该2种病毒的进一步相关研究报道相对较少[15]。结合以往在云南勐腊县采集的三带喙库蚊中首次分离到Toti病毒，本次在楚雄的2个县采集的三带喙库蚊中分离到Toti病毒，说明该病毒为云南三带喙库蚊主要携带的蚊媒病毒之一[15]。NDiV病毒，首次在越南采集的库蚊中分离到，我国2009-2011年在深圳市龙岗区的致倦库蚊标本中检测到我国4株Nam Dinh病毒，也通过系统进化树分析提示，4株深圳NDiV株与越南NDiV株的亲缘性较近，应属于同一个进化分支[16]。本次调查从4种蚊虫中也分离到NDiV，结合以往曾在大理南涧县和老挝库蚊中分离到NDiV病毒，说明该病毒不仅在云南蚊虫媒介种类多，而且地理分布广泛。

楚雄3个县蚊虫种类丰富度为4属15种，乙脑传播媒介三带喙库蚊、致倦库蚊，疟疾媒介中华按蚊、微小按蚊数量较多,属于当地优势蚊种；蚊虫携带病毒种类较多，共4种，其中三带喙库蚊携带JEV、BAV、Toti和Nam Dinh病毒,希氏库蚊携带Nam Dinh病毒，致倦库蚊携带BAV和Nam Dinh病毒，中华按蚊携带BAV和Nam Dinh病毒。结果提示相关部门应加强楚雄州虫媒和虫媒病毒的研究，可为未来楚雄州虫媒病毒与疾病流行关系的研究提供参考。

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Investigations of mosquito species and arbovirus in the part areas of Chuxiong Prefecture, Yunnan, 2014

WANG Jian1, GUO Xiao-fang1, BAO Jian-zhong2, DONG Xue-shu1,SUN Xiao-dong1,LIN Zu-rui1, JIANG Jin-yong1, ZHOU Hong-ning1

(1.YunnanInstituteofParasiticDisease/YunnanProvincialKeyLaboratoryofVector-borneDiseasesControlandResearch/YunnanProvincialCenterofArborvirusResearch/YunnanProvincialCollaborativeInnovationCenterforPublicHealthandDiseasePreventionandControl,YunnanCenterforMalariaResearch,Pu’er665000,China;2.ChuxiongCenterforDiseaseControlandPrevention,Chuxiong675000,China)

We investigated the species of mosquito and arborvirus in Yuanmou, Wuding and Shuangbai counties of Chuxiong Prefecture in Yunnan Province for providing effective evidences of local arbovirus borne infectious diseases control. We used mosquito trapping lamps in the survey point overnight to catch mosquitoes during the period from June to July in 2014, completing the morphological classification and identification of mosquitoes. In the laboratory, the supernatant were inoculated C6/36 cells to isolate the virus, the virus were identified by RT-PCR. Results showed that there were 15 species in 4 genus, 12 384 mosquitoes were collected by mosquito trapping lamps, of thoseCx.tritaeniorhynchus, An.sinensis,Cx.pipiensquinguefasciatusandAn.minimustheir percentages were respectively 59.95%,19.31%,10.90%and4.13%. Totally 29 cytopathic patches were found from 116 patches by C6/36 cells isolation, of those 4 arborviruses were identified fromCx.tritaeniorhynchus,Cx.pipiensquinguefasciatus,Cx.theileriandAn.sinensisby real-time PCR, i.e. They were Banna virus (BAV), Totivirus (TOV), Japanese encephalitis virus (JEV) and Nam Dinh virus (NDiV); their rates of positive patches of JEV, BAV, TOV and NDiV inCx.Tritaeniorhynchuswere 1.87%, 11.32%,3.77% and 9.43%, respectively, and that of NDiV inCx.theileriwas 25.00%, those of BAV and NDiV inCx.pipiensquinguefasciatusandAn.sinensiswere 20.00%、33.34% and 5.00%、7.50% respectively. There were many species of mosquito in Chuxiong Prefecture. TheCx.tritaeniorhynchusandAn.sinensiswere belonged to local predominant species, and the JEV, TOV, BAV and NDiV were isolated from them, which shows a higher epidemic risk of Japanese encephalitis and other arborvirus diseases in the investigate area.

Chuxiong Prefecture of Yunnan; mosquito; arborvirus; virus isolation; gene identification

Zhou Hong-ning, Email: zhn@yipd.org

周红宁，Email：zhn@yipd.org

1.云南省寄生虫病防治所、云南省虫媒传染病防控研究重点实验室、云南省虫媒病毒研究中心、云南公共卫生与疾病防控协同创新中心、云南疟疾研究中心，普洱665000；2.楚雄州疾病预防控制中心，楚雄675000

R373.3

B

1002-2694(2016)06-0581-08

收回日期：2016-01-25；2016-03-03

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.014