张慧娟, 刘东立, 贺　莉, 李　伟，张恩民，魏建春，纪建军，徐苏丽，刘　玮， 张发信，马国柱，石　一，马　琳，梁旭东



AP631炭疽噬菌体裂解蜡样芽胞杆菌的发现和鉴定

张慧娟1, 刘东立2, 贺莉3, 李伟1，张恩民1，魏建春1，纪建军3，徐苏丽3，刘玮3， 张发信3，马国柱2，石一2，马琳2，梁旭东1

目的AP631炭疽噬菌体裂解蜡样芽胞杆菌的发现和鉴定。方法通过革兰氏染色、菌落形态特征、噬菌体裂解试验、青霉素敏感试验、溶血试验、生化试验和蛋白质毒素结晶试验对炭疽疫点现场分离的5株菌进行蜡样芽胞杆菌的鉴定，通过PCR扩增、小白鼠毒力测定试验和MLST基因检测等方法对该5株菌和本实验室保存的3株被AP631炭疽噬菌体裂解的蜡样芽胞杆菌进行毒力和基因测定。结果确定了8株可被AP631炭疽噬菌体不完全裂解的蜡样芽胞杆菌。从疫点采集分离的5株菌青霉素敏感试验阴性，炭疽毒力基因PCR扩增阴性，排除了炭疽芽胞杆菌；蛋白质毒素结晶试验染色试验为阴性，排除了苏云金芽胞杆菌；根据溶血试验和生化反应等一系列鉴别实验鉴定为蜡样芽胞杆菌。8株菌的MLST基因检测发现5株菌有新的等位基因位点或ST型。结论本研究首次证明我国使用的炭疽芽胞杆菌诊断AP631噬菌体可以不完全裂解部分蜡样芽胞杆菌,存在非特异性裂解现象，提示在今后使用噬菌体鉴定炭疽杆菌时，对于外环境分离到的可疑芽胞杆菌，特别要注意关于噬菌体不完全裂解的问题，这将为炭疽诊断标准的正确制订提供新的认识并具有重要的指导意义。

AP631炭疽噬菌体；蜡样芽胞杆菌；鉴定

Supported by the Funded Project of the State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control (No. 2011SKLID210)(Zhang Hui-juan,Liu Dong-li and He Li contributed equally to this work).

2015年我们在调查处理陕西省延安市甘泉县炭疽疫情时，采集了该疫区外环境样本65份进行实验室病原分离鉴定，样本包括死畜宰杀地、掩埋地、牲畜放牧的草地、圈舍里的土壤、粪便、饲料和捕捉到的牛虻等。结果从土壤样本中分离到5株被炭疽芽胞杆菌(简称炭疽杆菌)AP631噬菌体不完全裂解的疑似菌株，经青霉素敏感试验和炭疽杆菌毒力基因检测均不符合炭疽杆菌的特征。为了确定是否存在可被AP631噬菌体裂解的其它芽胞杆菌属，我们对该5株菌进行了一系列鉴定，最终确定为蜡样芽胞杆菌(简称蜡样杆菌)，并对本实验室保存的333株蜡样杆菌做AP631噬菌体裂解试验排查，发现了3株可被AP631噬菌体不完全裂解的蜡样杆菌，首次证明我国使用的炭疽杆菌诊断用AP631噬菌体能够不完全裂解部分蜡样杆菌这一现象，存在非特异性裂解问题，同时对发现的8株蜡样杆菌进行了毒力测定实验和MLST基因检测分型。 现将研究结果报告如下。

1　材料和方法

1.1菌株来源5株菌株分离自疫点外环境土壤样本，3株菌株来源于本实验室保存的已经鉴定的333株蜡样杆菌中。蜡样杆菌对照株BC13061，苏云金芽胞杆菌对照株BT3为本实验室保存。

1.2AP631噬菌体噬菌体购自兰州生物制品研究所，生产批号20150301。

1.3采集样本和病原分离标本采集，处理和病原分离参见《炭疽防治手册》(1995)[1]。

1.4噬菌体裂解试验将被检菌纯培养物用接种环滴涂于LB琼脂或TSSB 琼脂平板上，滴加1滴相应诊断炭疽AP631噬菌体，置37 ℃条件下培养8 h后观察结果。

1.5炭疽杆菌鉴定实验

1.5.1青霉素抑菌实验将被检菌纯培养物用接种环滴涂于LB琼脂平板上，在琼脂平板表面贴放10U青霉素纸片，置37 ℃条件下过夜培养后观察结果。

1.5.2炭疽杆菌特异基因PCR检测PCR引物(表1)由北京天一辉远生物技术有限公司合成，PCR 反应扩增条件为预变性95 ℃ 5 min，1个循环；变性95 ℃，1 min，退火55 ℃，1 min，延伸72 ℃，1 min，共30个循环；最后72 ℃ 延伸5 min。PCR反应结束后经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

表1炭疽杆菌毒力基因PCR扩增引物信息

Tab.1Primers for virulence genes of B.anthracis

基因Gene上游引物Forwardprimer(5'-3')下游引物Reverseprimer(5'-3')产物长度/bpPCRproductpagAATTTGCGGTAACACTTCACTAGACCGTGACAATGATGGAA923rpoBCCAACAGTAGAAATGCCAATTTCACCAGTTTCTGGATCT197capCCTGGTTGTTCTTTTCGTTGCCGGATTGTATATGGAGTGGG1242

1.6苏云金杆菌蛋白质毒素结晶试验取经30 ℃培养24 h 并于室温放置6 d的营养琼脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s 后倾去，再通过火焰干燥，于载玻片上滴满蛋白质毒素结晶染色液(广州威佳科技有限公司)持续1～2 min，倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干后镜检。观察有无游离芽胞(浅红色)和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体，以苏云金芽胞杆菌为阳性对照。

1.7蜡样杆菌鉴定实验

1.7.1染色镜检挑取纯培养的单个菌落，革兰氏染色镜检。蜡样杆菌为革兰氏阳性芽胞杆菌，芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，菌体多呈短链或长链状排列。

1.7.2溶血试验挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TSSB 琼脂平板上，37 ℃培养24 h。蜡样杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。

1.7.3生化反应蜡样杆菌生化鉴定套装(购自北京陆桥技术有限公司)，用于蜡样杆菌的生化鉴定(GB/T 4789.14-2014)试验，包括西蒙氏枸橼酸盐、动力-硝酸盐培养基、MR-VP、木糖-明胶、甘露醇、葡萄糖共6种生化鉴定管和配套试剂。

1.7.4小白鼠毒力测定试验供试小白鼠为体重18～20 g的BALB/c小白鼠(雌雄各半) ，常规饲养。将供试菌株制备成108cfu/mL的菌悬液0.2 mL，每株菌为一组，每组6只，经皮下注射感染小白鼠，小白鼠皮下注射无菌1×PBS 0.2 mL/只作对照组，接种后观察其发病和死亡情况。

1.7.5MLST基因检测对可被AP631炭疽噬菌体不完全裂解的8株蜡样杆菌的7个看家基因(glpF，gmk，ilvD，pta，pur，pycA，tpi)的多位点序列分型(MLST)进行检测，引物见网址http：//pubmlst.org/bcereus。引物合成和PCR产物序列测定均由北京天一辉远生物技术有限公司完成。将测序结果与数据库中的相应基因比对，确定基因型。如有新的等位基因则向该网站提供原始测序数据，由网站指定菌株的新基因型。同时选取该网站已公布的不同ST基因型的蜡样杆菌属，其中包括炭疽杆菌和苏云金杆菌，与本研究的菌株进行比对，用Bionumerics 5.10软件建立数据库，分析各基因型，绘制基因型进化树。

2　结　果

2.1菌株特征及噬菌体裂解试验从65份环境样本中分离到5株AP631噬菌体不完全裂解的菌株，均为革兰氏染色阳性杆菌，菌落形态为典型卷发状，分别编号为BC01,BC02,BC03,BC04和BC06。本实验室保存的333株蜡样杆菌中有3株可被AP631噬菌体不完全裂解，编号为BC05,BC07,BC08，分别分离自云南、四川的土壤和河北的食品样本。代表株BC06菌株涂片革兰染色显微镜下观察和噬菌体不完全裂解现象见图1和图2，蜡样杆菌参考株BC13061不被AP631噬菌体裂解，作为阴性对照株。

图1　BC06菌株涂片革兰氏染色Fig.1　Gram staining for test strain named BC06

图2　AP631炭疽噬菌体裂解BC06菌株观察Fig.2　The test strain BC06 lysed by phage AP631

2.2炭疽杆菌鉴定实验

2.2.1青霉素抑菌试验结果显示BC01，BC02，BC03，BC04，BC06菌株均对青霉素不敏感， 不符合炭疽杆菌的特征。

2.2.2PCR扩增针对炭疽杆菌质粒基因pagA，cap和染色体rpoB基因对上述5株菌扩增均未扩增到目的条带(见图3)。

1和20为标准分子量，2-7为pagA基因扩增，8-13为cap基因扩增，14-19为rpoB基因扩增，其中泳道2、8和14为炭疽杆菌阳性对照，其余为菌株BC01，BC02，BC03，BC04和BC06。图3　pagA，cap和rpoB基因琼脂糖凝胶电泳检测Fig.3　Identification of gene of pagA，cap and rpoB by agarose gel electrophoresis

2.3苏云金杆菌蛋白质毒素结晶染色5菌株均没有发现染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体，排除苏云金杆菌，如图4所示，BT3为苏云金杆菌阳性对照。

2.4蜡样杆菌鉴定及检测实验

2.4.1溶血试验溶血反应显示BC01，BC02，BC03，BC04，BC06菌株均有约3 mm的溶血环，符合蜡样杆菌的特征。

2.4.2生化特征试验显示，5株菌均表现为：发酵葡萄糖，不发酵木糖、甘露醇，动力-硝酸盐培养基、明胶试验、甲基红试验和乙酰甲基甲醇试验(MR-VP)均为阳性，西蒙氏枸橼酸盐试验为阴性，符合蜡样杆菌的生化特征。

2.5动物试验BC01，BC02，BC03，BC04，BC06菌株感染小白鼠后在24～48 h内全部死亡。

2.6MLST基因检测8株蜡样杆菌的看家基因结果显示，有3株为已有ST基因型，其中BC06和BC08为基因型ST26，BC07为基因型ST785，其余5株菌均有1个或几个新的等位基因，提交测序原始数据后被指定了新的等位基因号和ST型，BC01，BC02，BC03，BC04，BC05菌株分别为基因型ST1137，ST1138，ST1139，ST1140和ST1141(表2)。

图4　5株菌蛋白质毒素结晶染色观察Fig.4　Protein crystallization dying experiment of the test strains

表2MLST分析 8株蜡样杆菌的看家基因情况

Tab.2Alleles and MLST profiles of the test strains

Strainno.AllelicgeneSTglpgmkilvDptapurpycAtpiBC01229*5248*240*127183*190*1137*BC02229*5248*240*16183*190*1138*BC038657818042128321139*BC04230*142*250*180 16149371140*BC05231*22118241*6666751141*BC0632315163426 BC07128879127785 BC0832315163426

注：*为新发现的等位基因和ST型。

Note：* New alleles and ST profiles.

基因型进化树如图5所示，8株菌中BC01、BC02和BC04单独成一簇，BC06和BC08基因型均为ST26，为含有呕吐毒素的一类蜡样杆菌，在我国其他地区也有报道，其余菌株则分散存在于不同的簇中。

图5　研究菌株与其他蜡样杆菌的基因进化树Fig.5　Phylogenetic tree of test strain and other Bacillus spp

3　讨　论

AP631炭疽噬菌体是1963年董树林和张守让从水样品中分离获得的，自发现以来一直作为炭疽杆菌诊断用噬菌体应用至今[1]。 AP631噬菌体为双链DNA，其分子量约49 kb[2]。炭疽噬菌体的敏感性决定其宿主域的宽窄，如果待检菌株是一株溶原性菌株，该菌株必本身携带有一个前噬菌体，否则不能被诊断噬菌体裂解；或者当炭疽杆菌在含碳酸氢钠培养基上，于CO2条件下培养时产生丰厚的荚膜物质掩盖细菌的噬菌体受体，使噬菌体不能被吸附在菌体表面，因此不能起到裂解作用。以往AP631炭疽噬菌体的敏感性和特异性研究显示它只裂解炭疽杆菌，对蜡样杆菌和其它需氧芽胞杆菌均不能裂解[3]。目前在我们的调查中发现了被噬菌体AP631不完全裂解的蜡样杆菌，证明噬菌体AP631有非特异性，其宿主域，不局限于炭疽杆菌，这在国内尚属首次发现和报道。

AP631炭疽噬菌体的非特异性现象的原因，推测可能在炭疽杆菌的近缘菌之间有某些共同的抗原或共同的噬菌体受体。Davison S等人报道了γ噬菌体的受体(GamR)，可能是位于细菌细胞壁上的含有LPXTG结构的表面蛋白，其编码基因序列为BA3367(BAS3121)，并揭示蜡样杆菌也具有同样的敏感蛋白，与炭疽杆菌上的GamR具有89%的相似

性，通过对苏云金杆菌基因测序分析，也具有类似的GamR编码序列，可与γ噬菌体结合，不发生裂解[4]。根据16sRNA序列分析显示蜡样杆菌、炭疽杆菌、苏云金杆菌和蕈状杆菌同为蜡样杆菌组[5]，本研究结果提示，是否蜡样杆菌也具有AP631噬菌体受体结构，其机制有待进一步的研究。

为了进一步了解这些菌株的毒力及基因特点，我们还进行了动物试验和管家基因检测，结果显示感染小白鼠均死亡，而基因分型显示其中3株单独成一簇，另外2株为相同基因型ST26，是含有呕吐毒素的一类蜡样杆菌，在我国其它地区也有报道，其余菌株则分散存在于不同的簇中，说明各菌株裂解域范围广泛。

通过本文报道提示我们在使用AP63噬菌体鉴定炭疽杆菌时，对于外环境分离到的可疑芽胞杆菌，特别对裂解不完全的现象判定要慎重。随着炭疽分子水平上的研究不断深入，关于炭疽的特异性引物不断有所报道，传统PCR以及实时荧光定量PCR的应用越来越成熟，可以进行实时PCR检测进行辅助诊断，以得到更加准确的鉴定结果，以防止漏检或出现假阳性，导致结果的误判误报，延误炭疽疫情的处置。这将为炭疽诊断标准的制订提供新的认识和对炭疽的防治具有重要的指导意义。

[1] Liang XD. A Manual of Anthrax Control and Treatment.[M]. Beijing: China Agricultural Press, 1995:27-30. (in Chinese)

梁旭东.炭疽防治手册[M].北京:中国农业出版社,1995:27-30.

[2] Wang BX, Zhang SR, Yu XM, et al.Characteristics ofBacillusanthracisbacteriophage AP631[J]. Chin J Virol, 1992, 8(2): 14-17. (in Chinese)

王秉翔，张守让,虞雪梅,等.炭疽芽胞杆菌噬菌体AP631的生物学特性检测[J].病毒学报,1992,8(2)：14-17.

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董树林,王秉翔.炭疽[M].西安:陕西科学技术出版社,2004:79-87.

[4] Davison S, Couture-Tosi E, Candela T, et al. Identification of theBacillusanthracis(gamma) phage receptor[J]. J Bacteriol，2005，187(19)：6742-6749.

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Detection and identification ofBacilluscereussusceptible to phage AP631

ZHANG Hui-juan1, LIU Dong-li2, HE Li3, LI Wei1, ZHANG En-min1, WEI Jian-chun1, JI Jian-jun3,XU Su-li3, LIU Wei3, ZHANG Fa-xin3, MA Guo-zhu2, SHI Yi2, MA Lin2, LIANG Xu-dong1

(1.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;2.ShanxiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Xi’an710054,China;3.Yan’anCenterforDiseaseControlandPrevention,Yan’an716000,China)

We identified the isolates which were susceptible to phage AP631, a specificBacillusanthracissusceptible phage. Five isolates ofBacilluscereusfrom soil in an anthrax endemic area and 3 preserved in our laboratory were identified by regular experiments including penicillin inhibition experiment, smear Gram staining, hemolysis testing, biochemical reaction, PCR analysis, mouse toxicity determination, protein crystallization dying experiment and MLST subtyping. All the tests supported the new bacterial isolates susceptible to AP631 phage wasB.cereusand excludedB.anthracisandB.thuringiensis. Three laboratory preserved isolates wereB.cereuswhich were identified previously. The fiveB.cereusisolates from soil were resistant to penicillin and PCR amplification targeted virulence genes showed negative in these strains. Protein crystallization dying experiment also displayed negative results, but the resultant biochemical reactions confirmed the 5 strains wereB.cereus. In addition, all 8B.cereusstrains were clustered as new allelic loci by MLST subtyping method. Our results demonstrate that bacterial phage AP631 is capable of lysingB.cereusin addition toB.anthracis, which suggests that there is some nonspecific lysis produced by AP631 and thereby we need pay more attention to the diagnosis ofB.cereusinfection to avoid misdiagnosis.

phage AP631;Bacilluscereus; identification

Liang Xu-dong, Email: liangxudong@icdc.cn

梁旭东，Email：liangxudong@icdc.cn

1.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京 102206；2.陕西省疾病预防控制中心，西安 710054；3.延安市疾病预防控制中心，延安 716000

R378.7

A

1002-2694(2016)06-0507-05

2016-02-03；

2016-04-28

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.001

传染病预防控制国家重点实验室资助项目(No.2011SKLID210)(张慧娟，刘东立，贺莉有同等贡献)