徐太哲，李　丽，王长山

(1.佳木斯市红十字医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)



小鼠外周血单个核细胞分离、纯化①

徐太哲1，李丽2，王长山2

(1.佳木斯市红十字医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

摘要:目的:探讨小鼠外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件，提高细胞获得率与纯度，以便后续分子生物学实验。方法:小鼠摘除眼球取血，设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化，分别采用EDTA-K2、肝素、枸橼酸钠 抗凝，Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度，计数存活率。结果:Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85%，细胞获得率最高可达80%以上，活细胞百分率在92%以上。结论:Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC，对后续分子生物学实验无影响。

关键词：小鼠;Ficoll密度梯度离心;PBMC

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)包括淋巴细胞和单核细胞。是免疫系统的重要组成，是研究免疫老化和衰老的主要依据。研究T、B淋巴细胞首要分离外周血单个核细胞，主要的分离方法是Ficoll-hypaque密度梯度离心法，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异，而得以分离[1]。离心后，单个核细胞因与分离液密度相当，集中在血浆层和分层液的界面上，呈白雾层，吸取该层细胞经洗涤离心即获得PBMC。PBMC分离是分子生物学试验常用的技术，其效果直接影响PCR等后续试验结果。实验对象小鼠因体重小，体内血液量少，Ficoll密度梯度离心法正适用这样少量血液的分离，本文探讨小鼠外周血单个核细胞的分离最佳条件。

1材料和方法

1.1材料与分组

BALB/c小鼠18只，5～6月龄，体重23～25g，雌雄不限；小鼠外周血单核细胞分离液试剂(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)。

1.2 方法

1.2.1取血与离心

摘除眼球取血：抓取小鼠，侧卧位，食指按压眼部皮肤致眼球突出。眼科弯镊迅速摘除眼球，倒立鼠，接取滴流血液。采血完毕纱布压迫止血[2]。每次采血量0.7～1mL。按乙二胺四乙酸盐(EDTA-K2)抗凝、肝素抗凝、枸橼酸钠抗凝，将抗凝血标本分为3个实验组，每组6例，相互对照[3]。

Ficoll密度梯度离心：首先取抗凝血与RPMI1640培养液等体积混匀，再加相当于抗凝血2倍体积的淋巴细胞分离液，于400～600×g离心20～30min，谨慎吸取单核细胞层，RPMI1640培养液洗两遍备用[4～7]。

因细胞获得率与纯度关系到实验效果，一般根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，其离心时间越长，最终目的是达到最佳分离效果，对于小鼠本实验依据离心力、离心时间等设置优化梯度，因细胞获得率的高低与室温还有关，室温设置3个优化梯度[8]。

1.2.2PBMC的差异贴壁法纯化

将获取的PBMC计数后，用单核细胞完全培养基以4×106个/mL的密度重悬细胞，将细胞铺于24孔培养板，每孔2×106细胞，放于37℃5%CO2培养箱中进行贴壁培养。2～4h内贴壁的为巨噬细胞前体(俗称为单核细胞)，吸去培养液上清，用RPMI1640培养液轻轻洗涤培养孔3次，去除非贴壁细胞。收集贴壁细胞即获得贴壁法纯化的PBMC。

1.2.3PBMCs纯度

收集贴壁细胞，用含有10%小牛血清的RPMI1640重悬后，涂片进行瑞氏(美蓝-伊红Y)染料，计数100个细胞，计算单个核细胞纯度，单个核细胞纯度=(淋巴细胞数+单核细胞数)/总细胞数×100%。

1.2.4计数PBMCs

洗涤1.2.2获得的PBMCs 2次，即加适量PBS或RPMI1640培养液、混匀、600g离心5min弃上清，重复2次。加PBS悬浮细胞，台盼蓝染液染色，死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。倒置显微镜10× 物镜下计数200个PBMCs活细胞百分率和细胞总数(存活率=活细胞数/总细胞数×100%)。

1.2.5统计学方法

2结果

2.1抗凝剂分离的PBMC细胞获得率、纯度、存活率

PBMC获得率：EDTA-K2组与肝素组比较差异显著(P<0.05)，EDTA-K2组获得率较高，而枸橼酸钠组与肝素组获得率比较，差异不显著，无统计学意义(P>0.05)。PBMC纯度：EDTA-K2组与肝素组比较差异显著(P<0.05)，肝素组PBMC纯度较高，而枸橼酸钠组与EDTA-K2组比较，纯度则差异不显著，无统计学意义(P>0.05)。PBMC存活率：EDTA-K2组、肝素组和枸橼酸钠组比较，细胞存活率差异不显著，无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　不同抗凝剂分离PBMC获得率、纯度、存活率

注：*P<0.05。

2.2不同离心力、离心时间的PBMC细胞获得率

在相同离心时间不同的离心力下，500g离心力下效果好于400g和600g；在相同离心力下时间越长收集的PBMCs细胞获得率越高，但不同时间下差异不显著，无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2不同离心力、离心时间的PBMC获得率

离心力时间20min25min30min400×g70.67±1.4672.05±1.4872.13±1.61500×g87.31±1.9589.90±1.3890.65±1.79600×g77.46±2.2180.78±1.9376.78±1.28

2.3不同环境温度下PBMC获得率

比较20℃、25℃和30℃三个环境温度下PBMC获得率，如表3可知，环境温度20℃时PBMC获得率最高，25℃次之和30℃最低，环境温度30℃PBMC获得率较20℃差异显著(P<0.05)。20℃与25℃下差异不显著，无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3　不同环境温度下PBMC获得率

注：*P<0.05。

3讨论

分离PBMC是一项实验和临床时常要做的工作,比如外周血单个核细胞培养的上清液中细胞因子等对基础医学和临床疾病有一定实用价值[9～14]。传统方法采用Ficoll-hypaque密度梯度离心，小鼠外周血单核细胞分离液比重为1.080，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异Ficoll在一定离心力的作用下离心时，血液中各组成成分将按密度的梯度重新聚集[15]。密度较低的血小板和血浆悬于分层液上部；密度较大的红细胞与粒细胞沉于分层液下部；由于PBMC密度稍低于分层液，则位于分层液界面上，小心吸取该层即可获得PBMC。该法操作需将抗凝血作适当稀释，比较适用于小鼠等血液量少的分离。特别说明，单核细胞分离液，在分离人PBMC时，其比重为1.077；而分离小鼠单个核细胞时比重为1.080。用本法分离PBMC，经条件优化后纯度可达85%，细胞获得率最高可达80%以上，活细胞百分率在92%以上。

PBMC的差异贴壁法纯化时，收集2～4h内贴壁贴壁细胞为巨噬细胞前体(俗称为单核细胞)，而10～24h内贴壁的细胞为内皮细胞、内皮祖细胞、干细胞，不贴壁的则为淋巴细胞[16]。总之，EDTA-K2组PBMC获得率较肝素组高，而肝素组PBMCs纯度较高，PBMC存活率三组细胞存活率差异不显著。另外据报道，枸橼酸钠对细胞损伤小些。环境温度在30℃PBMC获得率较20℃差异显著，超过25℃时会影响细胞获得率。综上所述，再考虑到细胞纯度、细胞回收率、细胞存活率以及操作的难易等因素，我们认为Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC，对后续分子生物学实验无影响。

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基金项目：①1.黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划，编号：1253G057;2.佳木斯大学自然科学基础研究类重点项目，编号：Sjz2012-11。

作者简介：徐太哲(1967～)男，吉林吉林人，本科，主治医师。 通讯作者：王长山(1977～)男，黑龙江佳木斯人，博士，副教授，硕士研究生导师。E-mail：wcs0451@163.com。

中图分类号：R446.11+3

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)04-0010-02

(收稿日期：2016-03-10)