罗小华，王　影，潘晓华，毕艳旭，王淑静，王　禹，韩小唯

(佳木斯大学附属第一医院儿内二科，黑龙江 佳木斯 154003)



左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织网格蛋白和dnmⅠ的表达影响①

罗小华，王影，潘晓华，毕艳旭，王淑静，王禹，韩小唯

(佳木斯大学附属第一医院儿内二科，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通过氯化锂—匹罗卡品(Li-pilo)致痫大鼠模型，探讨左乙拉西坦对大鼠海马组织网格蛋白和dnmⅠ的表达影响。方法：随机将健康Wistar雄性4周龄大鼠96只，分为生理盐水组，左乙拉西坦组，癫痫模型组，治疗组，共4组，每组24只。用Li-pilo给大鼠造模，然后第1、2、4周断头取四组脑组织，用免疫组化检测海马组织网格蛋白和dnmⅠ的表达。结果：用Li-pilo组均出现癫痫发作。网格蛋白和dnmⅠ的表达量，左乙拉西坦组与生理盐水组相比无差异，治疗组、癫痫模型组与生理盐水组相比表达量明显增强，治疗组与癫痫模型组相比表达量明显减少。结论：用Li-pilo组网格蛋白和dnmⅠ的表达水平明显增强，左乙拉西坦治疗癫痫效果明显，可能与它能减少癫痫大鼠海马组织中网格蛋白和dnmⅠ的表达有关。

关键词：左乙拉西坦；癫痫；网格蛋白；dnmⅠ；大鼠海马

癫痫是一种常见、反复因大脑神经元突发异常放电而发作、病因复杂的神经系统综合症，具体发病机制还不明确，是一种慢性的短暂的大脑功能障碍疾病。儿童神经系统发育未成熟，易发生癫痫，据国内多次大样本调查，60%癫痫患者起源于小儿时期，长期发作会导致脑损伤甚至持久神经精神障碍。经常癫痫使大脑神经元受损、突触重建容易异位和突触联系容易中止，严重影响脑的正常发育[1]。左乙拉西坦(Levetiracetam,LEV)是毗咯烷类具有全新抗癫痫作用的新型药物，治疗各种癫痫效果好，其主要可能是与突触囊泡蛋白2A结合发挥抗癫痫作用[2]。通过突触区神经递质释放，使神经元间信号传递，其中突触囊泡循环是神经元递质传递核心。Dynamin-Ⅰ，又称发动蛋白Ⅰ，即dnm1是一种突触前膜蛋白，只在脑、神经内分泌细胞及神经元突触连接部位中特异性表达，主要参与囊泡从细胞膜到细胞浆的内吞。dynamin-Ⅰ主要用处是接受各种调控后，聚集在囊泡颈部成环，此囊泡颈部被网格蛋白包裹内陷，然后GTP水解调节收缩，使囊泡与突触前膜分离，从而使胞吞过程完成[3]。网格蛋白是蛋白质复合体，由一条重链蛋白和一条与重链蛋白紧密伴随的轻链蛋白组成，对囊泡循环再生起关键作用。网格蛋白先招募后解离，分为[4]：开始招募衔接蛋白和网格蛋白；包被小凹内陷缢裂及液泡芽殖；包被液泡脱壳三个过程。

1材料与方法

1.1实验动物及分组

将96只健康Wistar大鼠(大连医科大学实验动物中心提供)，随机分四组： LEV组(左乙拉西坦组24只)，NS组(生理盐水组24只)，Li-pilo组(癫痫模型组24只)，Li-pilo+ LEV组(左乙拉西坦治疗组24只)，实验起始体重约为(200±20)g。

主要试剂：匹罗卡品和氯化锂(美国西格玛公司)、左乙拉西坦(比利时UCB.Pharma S.A.公司,批号：48167)、网格蛋白抗体和dnm1抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、多聚甲醛(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

①根据文献[5]建动物模型，测大鼠体重，治疗组、癫痫模型组先腹腔注射氯化锂125mg/kg，21h后给东莨菪碱1.6mg/kg，30min后注射匹罗卡品80mg/kg。观察大鼠行为，凡连续出现3次Ⅲ～Ⅴ级发作者造模成功，癫痫发作程度按Racine标准：0级：没有抽搐；I级：面、耳抽动；Ⅱ级：节律性点头；Ⅲ级：前肢震颤；Ⅳ级：前肢伸值伴身体立起；Ⅴ级：跌倒和全身阵挛。造模成功一直抽搐30min后，立即注射地西泮10mg/kg，使发作停止。造模成功24h后，治疗组和左乙拉西坦组每天灌胃左乙拉西坦200mg/kg，生理盐水组及癫痫模型组每天灌胃等剂量生理盐水，连续4周动态观察，并分别于第1、2、4周取四组海马组织(用多聚甲醛保存)用于实验。

②用免疫组化检测网格蛋白和dnm1的表达水平 分别于li-pilo或生理盐水注射前，注射后1W、2W、4W对着大鼠，用多聚甲醛给左心灌注，接着取海马组织，然后放入4%多聚甲醛，使其固定海马组织30min以上，最后用4℃冰箱保存备用。海马组织固定48h后切成2mm厚组织块；进行梯度乙醇脱水；二甲苯透明:二甲苯Ⅰ25min、二甲苯Ⅱ20min；浸蜡:石蜡Ⅰ熔点 52～54℃/40min、石蜡 II熔点 56～58℃/1h；包埋：石蜡Ⅲ熔点 60～61℃，包埋后轮转式切片机切厚4μm片，56℃/4h烘干作为备用。进行免疫组化，显微镜下发现棕黄色颗粒时，把显色反应停止，再次用酒精脱水和二甲苯透明，最后树胶封片、镜下观察、照相[6]。

1.3统计学方法

表示，组间差异比较用方差分析，两两比较用LSD法，检验水准α为0.05有统计学意义。

2结果

2.1动物行为观察

大鼠癫痫样的发作在打针pilo大约15min后，行为：点头，前肢阵挛抽搐，前肢伸直伴有身体立起，跌倒甚至全身惊厥。发作持续抽搐30min后立即注射地西泮终止抽搐。最后左乙拉西坦每天灌胃，结果治疗组大鼠癫痫发作渐渐减少。

2.2LEV对网格蛋白和dnm1的表达量

网格蛋白和dnm1的免疫反应产物重点集中在海马区，各时间段生理盐水组和左乙拉西坦组dnm1和网格蛋白OD比较，其差异无统计学意义(P>0.05)；各时间段癫痫模型组dnm1和网格蛋白OD与生理盐水组比较，结果增高，其差异有统计学意义(P<0.05)；各时间段治疗组dnm1和网格蛋白OD与癫痫模型组比较，结果降低，其差异有统计学意义(P<0.05)。见表1～2。

表1　各组大鼠网格蛋白OD比较

注:a与NS组比较P<0.05；b与LEV组比较P<0.05；c与Li-pilo组比较P<0.05。

表2　各组大鼠dnm1OD比较

注:a与NS组比较P<0.05；b与LEV组比较P<0.05；c与Li-pilo组比较P<0.05。

3讨论

癫痫是比较严重神经系统疾病，尤其是难治性癫痫的反复发作给患儿本身带来了极大的痛苦，长时间的看护与治疗也给患儿的家庭带来了巨大的负担。癫痫发病机制复杂，主要通过加强突触囊泡循环使神经元高度同步化激活，导致脑神经元过度异常放电[7]。突触囊泡循环是神经递质传递的基础，癫痫患者神经元突触出问题，它功能明显异常，通过加强突触囊泡循环，使突触传递的神经冲动大大增加，从正常情况下数次或数十次每秒立即增加至数十次到数百次每秒，导致痫性放电到处传播和散开[8]。网格蛋白和dnm1是囊泡循环中两大重要蛋白。突触囊泡循环主要包括胞吐、胞吞以及囊泡在细胞内的循环三个过程，其中，囊泡膜内吞回收主要方式是网格蛋白介导的内吞，其在囊泡循环再生中起关键作用，并且在囊泡的内吞过程中，需要依赖Dnm1从胞膜上剪切囊泡。Dnm1参与网格蛋白介导的内吞过程，把每个囊泡回收到突触前终末，使囊泡里面的神经递质准备下一次释放，是囊泡再摄取过程中囊泡的必需成分。据相关研究报道，癫痫发作时Dnm1水平均显著增强[9]，Dnm1的过度表达可能是维持这种异常同步放电的物质基础。内吞包括网格蛋白依赖及非网格蛋白依赖两种方式，癫痫突触囊泡循环再生主要通过网格蛋白依赖内吞，研究发现癫痫发作时网格蛋白表达增强[10]，结果囊泡回收加强，通过突触扩布，形成异常高频的痫样放电，最终导致癫痫临床发作。

本文通过实验也证实了这一结果并发现随着癫痫发作时间延长网格蛋白和Dnm1表达增强越明显。左乙拉西坦是一种抗癫痫新型药物，安全性高，不良反应少，几乎不影响肝肾功能及血液系统，可能与突触囊泡蛋白2A结合，使神经递质的释放受影响，从而抗癫痫。本实验发现，癫痫大鼠中网格蛋白和Dnm1表达增强，使突触囊泡循环再生加强，促进囊泡回收，加重癫痫。LEV能很好控制癫痫发作，作用机制之一可能是通过下调海马区网格蛋白和Dnm1表达发挥其抗癫痫作用。但癫痫发病机制非常复杂，是多因素导致结果，海马区网格蛋白和Dnm1表达的下调是否是LEV控制癫痫发作的作用机制还需进一步研究。

参考文献:

[1]冯宏达,王禹,王海燕,等.左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中突出后致密物PSD-95表达的影响[J]. 黑龙江医药科学,2014,37(04):63-64

[2]毛诗贤,冯亚梅,楚兰,等.杏仁核点燃癫痫大鼠模型海马组织突触囊泡蛋白2A的表达变化[J].中风与神经疾病杂志,2012,11:1008-1011

[3]Doherty G J, M cM ahonHT. M echan ism s of endocy tos is An-nu R ev Biochem, 2009,78:857-902

[4]姚鹏程,叶恭银. 网格蛋白介导的内吞作用机制[J]. 生命科学研究,2003,S1:22-25+69

[5]Lynch BA,Lambeng N，Nocka K，et al.The synaptic vesicle protein SV2A is thebinding site for the antiepileptic drug levetiracetam[J].ProcNatlAcad SciU SA，2004，101(26)：9861-9866

[6]裴艳莹,邹艳红,王海燕,等. 左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中CAMKⅡ及NCX3表达的影响[J]. 黑龙江医药科学,2015,38(04):31-34

[7]Aarts MM，Tymianski M.Molecular Mechanisms Underlying Specificity of Excitotoxic Signaling in Neurons[J].Curr Mol Med，2004，4(2)：137-147

[8]Schmid E M，Mcmahon H T.Integrating molecular and network biology to decode endocytosis[J].Nature,2007,448(7156):883-888

[9]肖争. 癫痫突触机制中发动蛋白、突触融合蛋白、突触囊泡膜蛋白及相关蛋白研究[D].重庆医科大学,2010

[10]龚云,王学峰,汪建华,等. 难治性癫癎患者脑组织突触囊泡回收相关蛋白的表达[J]. 中华神经科杂志,2006,03:155-158

基金项目：①佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：LM2015_016。

作者简介：罗小华(1986～)男，湖南邵阳人，在读硕士研究生。 通讯作者：王海燕(1957～)女，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail：276137680@qq.com。

中图分类号：R749.1+7

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)04-0095-02

(收稿日期：2016-01-08)