吴开奇钟 琦周平玉　楼永良*. 温州医科大学检验医学院，检验医学教育部重点实验室（浙江温州　505）；. 上海市第十人民医院检验科； . 上海市皮肤病医院性病科；



比较PCR-荧光探针法与其他方法对性病门诊中衣原体和淋球菌检出率的影响

吴开奇1钟 琦2周平玉3楼永良1*
1. 温州医科大学检验医学院，检验医学教育部重点实验室（浙江温州325035）；2. 上海市第十人民医院检验科； 3. 上海市皮肤病医院性病科；

摘要目的 比较PCR-荧光探针法与乳胶法（即沙眼衣原体抗原检测法）和淋球菌培养法对性病门诊就诊者生殖道分泌物中沙眼衣原体和淋球菌检出率，控讨PCR-荧光探针法的优势。方法 采集2015年3月至2015年12月上海市皮肤病医院虬江分院性病门诊就诊的428位患者的生殖道分泌物，采用PCR-荧光探针法检测分泌物中的衣原体和淋球菌，并与乳胶法和淋球菌培养法对比。结果 （1）PCR荧光探针法在衣原体的检测中，428份标本中衣原体阳性检出率显著高于乳胶法（9.95% vs 4.21%）P＜0.01。（2）PCR荧光探针法在淋球菌的检测中，428份标本中淋球菌阳性检出率显著高于淋球菌培养法（7.24% vs 2.80%，P＜0.01）。（3）PCR荧光探针法在性病门诊的应用显著增加衣原体和淋球菌阳性率的检出，有助于临床感染的早期诊断和及时治疗。结论PCR-荧光探针法的敏感性显著高于乳胶法和淋球菌培养法，适合广泛应用于性病门诊中检测衣原体和淋球菌，有助于临床早期诊断和治疗。

关键词衣原体， 沙眼；奈瑟球菌， 淋病；PCR-荧光探针法

衣原体和淋病双球菌是引起泌尿生殖道感染的常见病原体，在女性感染患者中可以引起宫颈炎，尿道炎、盆腔炎、异位妊娠、早产及不孕，甚至可以通过垂直传播引起婴儿眼结膜炎和呼吸道感染等严重后果［1-3］；男性感染者则可以发生前列腺炎、尿道炎、附睾炎症等不良结局［4］。研究显示，当患者有衣原体感染而无临床症状的出现时，往往感染被疏忽，而导致后续严重的并发症［5］。同样，女性淋病大多无症状，在临床上也常常易被漏诊，最终导致慢性盆腔综合征等严重后果［6］。更棘手的是传统的衣原体抗原检测法敏感性较低，约为50%～70%，衣原体培养法耗时，操作复杂，对实验人员要求高，临床很少应用［7］；同时临床发现女性淋病大多数无症状，往往会延迟就诊而影响培养结果，造成对结果的误判。这些因素均给临床诊断和治疗带来困扰，因此早期发现病原体的存在，及时采取治疗措施可以避免不孕不育等严重不良结局的产生。本研究主要采用了PCR-荧光探针法检测性病门诊采集的生殖道分泌物标本中衣原体和淋球菌，并与乳胶法（即沙眼衣原体抗原检测法）及淋球菌培养法比较分析，探讨荧光PCR方法在生殖道分泌物样本中用来检测衣原体和淋球菌的优越性，分析其对性病门诊中衣原体和淋球菌阳性检出率的影响。

材料和方法

一、研究对象

本实验的研究对象为2015年3月份到12月份于上海市皮肤病医院虬江路分院性病科门诊就诊且疑有泌尿生殖道感染的患者，所有患者在近一周内未使用抗生素。标本采集方法为将无菌拭子轻轻伸入男性尿道口内2～3 cm处或女性宫颈口内1～2 cm处捻转数次并停留2min后取出，将拭子头浸入无菌生理盐水标本管中和特殊培养基中保存，待测衣原体、淋球菌等。在此期间一共采集到428位患者的尿道或宫颈分泌物，患者平均年龄（34.3±10.3）岁，范围（5～78）岁，其中男性271名，平均年龄为（35.8±10.1）岁；女性157名，平均年龄为（31.7±9.2）岁；主要研究人群年龄段为20～40岁，占总人数的77%。

二、检测方法

（一）PCR-荧光探针法

衣原体、淋球菌检测的试剂由上海科华生物工程股份有限公司提供，检测步骤一致，按照试剂盒说明书操作及荧光PCR仪器的软件分析，得到样本的检测结果。PCR反应条件为样本在50℃用UNG酶处理反应2min，93℃预变性2min，93℃变性10s，60℃退火、延伸及检测荧光30s，共40次循环。

（二）乳胶法（即沙眼衣原体抗原检测法）

在标本处理管中加入标本处理液A8滴，将采集样本拭子与A液体反复挤压混匀，再加入标本处理液B 8滴，充分混匀后取3滴至反应板加样孔中，10～20 min后观察结果。试剂由杭州艾博生物医药有限公司供应，详细操作和步骤严格按照试剂说明书进行。

（三）淋球菌培养法

淋球菌培养采用Thayer-Martin 选择性琼脂基础（MTM琼脂基础）培养基，将采集的拭子标本接种至培养基中，在5% CO2温箱35℃培养48～72h后再进行判断结果。

三、结果判断

PCR-荧光探针法：阳性结果为样本循环域值（cycle threshold， Ct）≤37，而Ct无数值或＞40的样本为阴性结果，若37＜Ct＜40的样本进行复测，复测结果＜40为阳性，否则为阴性。

乳胶法：10～20 min后在质控条带和反应区均出现红色条带为阳性结果；只在质控区呈现红色条带为阴性结果；若是质控区无红色条带出现，试剂失效，应更换试剂重新检测。

培养法：挑取直径0.5～1.0 mm圆形、凸起、湿润光滑、半透明或灰白色、边缘呈花瓣状的典型菌落，分别进行革兰染色和氧化酶反应，并挑取菌落传代待做进一步生化反应；氧化酶实验于3～5 s内出现鲜红色后变成黑色和革兰染色后镜下可见革兰阴性肾形双球菌，则判断为淋球菌阳性。

四、统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，不同方法阳性检出率的比较采用x2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结　果

一、PPCCRR-荧光探针法与乳胶法对生殖道分泌物中衣原体检出率的比较

P C R -荧光探针法对衣原体检测阳性率为9.35%，远远高于乳胶法4.21%（P＜0.01），并且分别在男性和女性中的阳性检出率也都明显高于乳胶法（男，9.96% vs 4.06%，P＜0.01；女，8.83% vs 4.45，P＜0.05），不同年龄群中也都高于乳胶法，见表1（＜20岁人群研究对象较少，故无意义）。

表1　PCR--荧光探针法和沙眼衣原体抗原检测法对衣原体的检测结果比较

二、PPCCRR-荧光探针法与淋球菌培养法对生殖道分泌物中淋球菌检出率的比较

淋球菌PCR-荧光探针法阳性检出率高于培养法（7.24% vs 2.80%，P＜0.01）；在男性和女性中其阳性率也显著高于培养法（男9.96% vs 3.69%，P＜0.01；女2.55% vs 1.27%，P＞0.05），不同年龄段PCR荧光探针法阳性检出率高。见表2（＜20岁人群研究对象较少，故无比较意义）。

三、PPCCRR荧光探针法与乳胶法及淋球菌培养法对性病门诊就诊者衣原体和淋球菌阳性检出率的影响分析

428名就诊者中衣原体和淋球菌两种检测方法的最终结果显示，PCR 荧光探针法检测衣原体阳性有40例（阳性率9.35%），淋球菌阳性有31例（阳性率7.24%）；而乳胶法检测沙眼衣原体测阳性只有18例（阳性率4.21%），淋球菌培养法阳性只有12例（2.80%），这远远低于PCR荧光探针法；在男性和女性中同样显示PCR荧光探针法在衣原体和淋球菌检测中的阳性率高；在对就诊患者按年龄分布分析后发现在21～40年龄段检查衣原体和淋球菌的人数最多，但乳胶法和淋球菌培养法的检测阳性率均较低，远远低于PCR荧光探针法；＜20岁就诊者人数较少，其结果无意义，见图1。以上结果PCR荧光探针法检测衣原体和淋球菌中有较高的灵敏度，可以提高衣原体和淋球菌阳性检出率，有利于就诊患者的早期诊断和治疗，尤其是性病门诊中就诊患者多为生育阶段人群并且部分患者无临床症状表现，可以避免不孕不育严重后果的发生。

表2　PCR--荧光探针法和淋球菌培养法对淋球菌检测结果的比较

讨　论

衣原体、淋球菌是常见的性传播感染的病原体，目前其感染率在世界范围内一直居高不下并呈上升态势［8，9］。尽管大多数男性淋球菌感染后可以出现尿频、尿急、尿道流脓等急性症状，但大多数衣原体感染者及女性淋病患者感染后可以呈隐匿状态长期潜伏或因患者无临床症状或症状轻微，未及时就诊引发多种并发症，产生严重的后果［5，6］。已知，衣原体、淋球菌感染可以引起育龄期人群的不孕不育，而长期感染更是主要罪魁［3，10］，而且无症状的感染者同时是最危险的传染源，给家庭和性伴的健康带来隐患。因此，对衣原体、淋球菌的隐匿感染不容忽视，早期发现，及时治疗，对切断传染源、预防并发症意义重大，敏感和可靠的诊断技术是实现这一目标的前提条件。

图11　PPCCRR荧光探针法较其他方法检测衣原体和淋球菌的阳性率比较A：PCR荧光探针法和乳胶法检测衣原体阳性率比较；B： PCR荧光探针法和淋球菌培养法检测淋球菌阳性率比较

目前衣原体、淋球菌感染的确诊主要依赖实验室检查［8］，因此可靠的实验室结果是诊断的关键环节。乳胶法检测沙眼衣原体已经被广泛应用于临床实验室，方法简便、快捷，但敏感性不够［11］；培养法被认为是病原体检测的“金标准”［12］，但操作复杂、耗时长，费用昂贵，淋球菌培养法在淋球菌的检测中具有高度特异性，但该方法易受到标本采集、运送、保存等诸多因素的影响，尤其是女性感染时间较长的患者，结果可出现假阴性，而且需要48 h或更长时间才能得到结果［13］，期间患者因得不到及时治疗可导致病原体的进一步传播。PCR技术具有较高的敏感性和特异性，已有研究应用于结核杆菌、梅毒螺旋体、艾滋病毒等病原体感染的诊断和疗效判断中［14-16］。本研究中采集到我院性病门诊428份生殖道分泌物的标本，利用PCR-荧光探针法分别检测衣原体和淋球菌，并与乳胶法和淋球菌培养法比较。结果显示PCR荧光探针法在衣原体和淋球菌的检测中，其阳性率显著高于乳胶法和淋球菌培养法，PCR结果与其他相关研究也较为一致［17-19］，这提示我们乳胶法和淋球菌培养法可能不能完全满足临床诊断需求。在我们入组的患者中，部分患者有生殖道刺激症状的出现，乳胶法检测沙眼衣原体为阴性，而PCR法可以检测到衣原体的存在，对患者的诊断和治疗提供了明确的依据。考虑到PCR方法检测的是病原体的核酸，可能存在治疗后病原体核酸没有清除而造成检测结果的假阳性，我们特别关注首次就诊时仅有PCR阳性而无临床症状的患者，对这些患者进行治疗后7d随访，结果显示衣原体PCR结果均转阴（结果未展示）。值得一提的是，2例女性其丈夫淋球菌培养和PCR都为阳性，临床明确诊断为淋病，但她们淋球菌培养结果为阴性，PCR阳性，此时若仅仅依靠淋球菌的培养就会造成患者的漏诊，留下健康隐患。PCR-荧光探针法操作步骤简单，反应时间短，结果判定简单客观，灵敏度高且特异性好，不易受外界其他因素影响，克服了传统PCR交叉污染易出现假阳性的缺点［20］，在规范化实验室的前提下，此方法适合应用于临床检测大量样本和在门诊就诊患者中作为筛查方法。同时我们的研究显示，性病门诊中21-40岁的就诊者人数最多，此年龄段人群处于生育阶段且性生活较为活跃，是衣原体和淋球菌感染的重点关注对象，而衣原体和淋球菌的感染可引起不孕不育，PCR荧光探针法的应用可以避免不孕不育等严重结局的发生。

总之，通过本研究的阐述表明PCR-荧光探针法技术在衣原体和淋球菌检测中的应用可以提高检出率，对临床衣原体和淋球菌的感染的早期诊断有重要意义，尤其是在生育阶段人群和无症状感染患者中，早期发现和及时治疗可以避免不孕不育等严重不良结局的发生。

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（2016-01-08收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.005

中图分类号R 759

*通讯作者，Email： lyl@wzmc.edu.cn

Detection rate analysis of Chlamydia and gonococcal infection in STD clinic using PCR fl uorescence probe method

Wu Kaiqi1， Zhong Qi2， Zhou Pingyu3， Lou Yongliang1*
1. School of Laboratory Medicine， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325035， China；2. Clinical laboratory， Shanghai Tenth People's Hospital， Shanghai； 3. STD Institute， Shanghai Skin Disease Hospital， Shanghai Corresponding author： Lou Yongliang， Email： lyl@wzmc.edu.cn

AbstractObjectiveTo comparatively analyze the detection rate of trachomatis and gonorrhoeae in genital tract secretion using PCR fluorescence probe method， Emulsion method， and Neisseria gonorrhoeae culture method. MetthhooddssGenital tract secretion samples of 428 patients from Qiujiang Branch of Shanghai Skin Disease Hospital STD clinic during March 2015 to December 2015 were collected. Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae in genital tract secretions were detected by PCR- fl uorescent probe， Emulsion method and Neisseria gonorrhoeae culture method， respectively. Ressuullttss（1） Among 428 specimens， the positive rate of Chlamydia using PCR- fluorescent probe method was significantly higher than that using Emulsion method（9.95% vs 4.21%）， P＜0.01. （2） Among 428 specimens， the positive rate of Neisseria gonorrhoeae using PCR- fl uorescent probe method was signifi cantly higher than that using Neisseria gonorrhoeae culture method（7.24% vs 2.80%），P＜0.01. （3） PCR- fl uorescent probe method signifi cantly improved the detection rate of Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae， it also improved early diagnosis and therefore treatment of Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae infection. ConcluussiioonnDue to the higher sensitiveness of PCR- fl uorescent probe method， it can be widely used in the STD clinics to detect the Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae， which are helpful to early diagnosis and treatment of Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae infection.

Key wordschlamydia trachomatis；neisseria gonorrhoeae；PCR fl uorescence probe method