赵宸，王艳，方媛，黄珍珍，任伟，陈薇，王丽华，胡闻，王科，倪力军

(安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，a 肾脏内科，b 病理科，合肥 230001)



·基础研究·

雷米普利通过抑制胰岛素样生长因子-1减轻糖尿病肾病大鼠肾系膜基质聚集的研究

赵宸a，王艳a，方媛a，黄珍珍a，任伟a，陈薇a，王丽华a，胡闻b，王科a，倪力军a

(安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，a 肾脏内科，b 病理科，合肥 230001)

[摘要]目的探讨雷米普利对糖尿病肾病(DN)大鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达及肾系膜基质聚集的影响。方法SD大鼠分为健康对照组(NC组，n=12)、DN组(n=11)、DN雷米普利干预组(DN+RAM组，n=12)，腹腔注射链脲佐菌素构建DN模型，DN+RAM组予雷米普利3 mg·kg-1·d-1灌胃8周，检测肾重/体质量、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐；HE染色和电镜观察肾脏病理改变；免疫组织化学检测肾组织IGF-1表达；Western blot检测IGF-1、纤维连接蛋白(FN)、IV型胶原(Col-IV)和基质金属蛋白酶(MMP)-2表达。结果与NC组比较，DN组大鼠肾重/体质量、FBG、HbA1c、24h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐明显升高，肾小球肥大和系膜基质聚集明显，IGF-1、FN和Col-IV蛋白表达明显增加，MMP-2表达明显降低(P<0.05)。与DN组比较，DN+RAM组上述指标除FBG和HbA1c外均明显改善(P<0.05)。IGF-1蛋白表达与24 h尿蛋白定量(r=0.937)、FN(r=0.896)和Col-IV(r=0.871)表达呈显著正相关，与MMP-2(r=-0.826)呈显著负相关(P<0.05)。结论雷米普利可通过抑制IGF-1的表达，减轻肾系膜基质聚集，发挥肾脏保护作用。

[关键词]糖尿病肾病；胰岛素样生长因子Ⅰ;雷米普利；大鼠,Sprague-Dawley

1材料与方法

1.1实验动物及制备模型健康SPF级雄性8周龄SD大鼠36只，体质量(190±10)g，由安徽医科大学实验中心提供，合格证SCXK(皖)2005-001，自由饮食饮水，适应性饲养1周。采用随机数字表法将其随机分为健康对照组(NC组， 12只)、DN组(12只)和DN雷米普利干预组(DN+RAM组，12只)。DN组和DN+RAM组大鼠禁食14 h后予腹腔注射单剂量STZ(美国Sigma公司)60 mg/kg，48 h、72 h及1、2、4周末空腹采尾静脉血，并留取尿液。血糖>16.7 mmol/L且尿蛋白排泄率大于30 mg/24 h视为DN大鼠模型构建成功[5]。DN组中1只大鼠血糖未达标予剔除，余均造模成功。NC组予腹腔单次注射等量枸橼酸缓冲液。造模成功后，DN+RAM组大鼠予雷米普利(法国赛诺菲-安万特公司产，2.5 mg/片，批号：H20040517)3 mg·kg-1·d-1灌胃8周，NC组和DN组予等量蒸馏水灌胃。实验期间喂标准饲料，自由饮水，不用胰岛素。

1.2标本采集第8周末处死大鼠前于代谢笼留取24 h尿液。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，心脏采血4～5 mL并离心分离血清，测定生化指标。称量左肾重量，计算肾重/体质量(mg/g)；部分组织用10%中性甲醛固定并石蜡包埋，其余置于冰上剪碎，冻存于-80 ℃冰箱。

1.3指标测定

1.3.1生化指标采用日立7600-020型全自动生化分析仪测定空腹血糖、血尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)水平，亲和层析法检测糖化血红蛋白(HbA1c)，免疫比浊法测定24 h尿蛋白定量。

1.3.2肾脏病理蜡块连续2～3 mm切片，常规脱蜡后行苏木素-伊红(HE)染色，400倍光镜下观察肾脏组织形态学改变，每切片随机取10个不同视野采集图片。部分肾皮质切成l mm3的立方小块用2.5%戊二醛固定，制作超薄切片，铅铀双染色后在日产JEM-1230型透射电子显微镜下观察各组肾脏病理变化。

1.3.3免疫组织化学采用Elivision法检测肾组织IGF-1的表达。蜡块连续4 mm切片，脱蜡水化后用3% H2O2封闭，消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗后，滴加兔抗大鼠IGF-1抗体50 μL(武汉博士德公司)，4 ℃过夜，以PBS代替一抗作阴性对照。滴加聚合物增强剂和酶标羊抗兔聚合物(福州迈新生物技术开发公司)，37 ℃ 20 min。滴加DAB显色剂，显微镜下控制显色，苏木素复染，脱水透明，树胶封片。200倍光镜下随机选取皮质区20个视野，棕黄色颗粒为阳性，采用全自动图像分析系统(Image Pro Plus 6.0)检测IGF-1阳性信号的累积吸光度和总面积，计算阳性信号的平均吸光度值(AOD)。

1.3.4Western blot从冻存肾组织取100 mg加入组织总蛋白提取液1 mL，冰上裂解30 min。4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定总蛋白浓度。取60 μg蛋白经SDS-PAGE电泳后以260 mA电转90 min至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h。分别加入兔抗大鼠 IGF-1、FN、Col-IV和MMP-2单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，均按1 ∶1000稀释，4℃孵育过夜。TBST洗膜后加辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗，室温孵育1h后ECL液进行显色。采用 Quantity One 软件分析条带，以目的蛋白与同一标本内参照β-actin的灰度比值作为该目的蛋白的相对表达量。

2结果

2.1一般情况及生化指标的比较给药8周后，与NC组比较，DN组大鼠出现明显多饮、多食及多尿症状，精神较差，活动减少，DN+RAM组上述症状较DN组有改善。与NC组比较，DN组和DN+RAM组肾重/体质量、空腹血糖、HbA1c、24 h尿蛋白、血BUN和Cr均显著升高(P<0.05)。与DN组比较，DN+RAM组除空腹血糖和HbA1c差异无统计学意义(P>0.05)外，其余指标均显著降低(P<0.05)，见表1。

表1　第8周时各组大鼠一般情况及生化指标比较 ±s)

注：与NC组比较，aP<0.05；与DN组比较，bP<0.05

2.2肾脏组织病理学改变HE染色400倍镜下示：NC组肾小球形态和结构无明显异常改变；DN组肾小球肥大，系膜细胞增生，细胞外基质明显增多，系膜区扩大；与DN组比较，DN+RAM组上述病理改变明显改善，肾小球缩小，系膜细胞数减少，细胞外基质轻度增生，见图1。

电镜结果示：与NC组比较，DN组肾小球基底膜增厚，系膜区基质增生、肿胀，有少许电子致密物质沉积；与DN组比较，DN+RAM组肾小球基底膜无明显增厚，系膜区基质轻度增生，见图1。

2.3肾组织FN、Col-Ⅳ和MMP-2蛋白的表达Western blot结果示：与NC组比较，DN组和DN+RAM组大鼠FN和Col-IV蛋白均显著增加，MMP-2蛋白显著降低(P<0.05)；与DN组比较，DN+RAM组FN和Col-IV蛋白均显著下调，MMP-2蛋白显著上调(P<0.05)，见表2。

表2　各组FN、Col-IV、MMP-2和IGF-1蛋白相对

注：与NC组比较，aP<0.05；与DN组比较，bP<0.05

2.4肾组织IGF-1的表达NC组肾组织有少量IGF-1表达，DN组肾组织IGF-1表达量明显升高，以胞浆和胞核着色为主，主要表达肾小球系膜区，肾小管也有表达，AOD值为0.37±0.02；DN+RAM组IGF-1肾小球系膜区染色减轻，AOD值为0.24±0.03，较DN组显著下降(P<0.05)，但仍显著高于NC组(P<0.05)，见图1。

Western blot结果示：与NC组比较，DN组和DN+RAM组IGF-1蛋白表达显著增加(P<0.05)；与DN组比较，DN+RAM组IGF-1蛋白表达显著降低(P<0.05)，见表2。

2.5相关性分析Pearson相关性分析结果示IGF-1蛋白表达与24 h尿蛋白定量(r=0.937)、FN(r=0.896)和Col-IV(r=0.871)蛋白表达呈显著正相关，与MMP-2呈显著负相关(r=-0.826，P<0.05)。

3讨论

系膜区细胞外基质的过度聚集是DN的最主要病理特点，是FN、Col-IV和层黏连蛋白(LN)等基质蛋白合成增多和MMP-2表达降低引起基质降解减少的共同结果[6]。MMP-2为锌依赖的基质金属蛋白酶，是降解系膜中FN、Col-IV和LN蛋白的主要明胶酶，可减少细胞外基质的聚集[7]。

本实验Western blot结果示DN组MMP-2蛋白明显下降，FN和Col-IV蛋白明显升高，免疫组织化学和Western blot结果均示DN组IGF-1蛋白表达明显升高，同时IGF-1蛋白表达增加，与MMP-2呈负相关，与24 h尿蛋白、FN和Col-IV呈正相关，提示IGF-1可能通过下调MMP-2，使其对FN和Col-IV蛋白的降解作用减弱，加剧系膜基质大量沉积，最终引起尿蛋白升高。使用雷米普利治疗DN大鼠8周后，肾重/体质量、24 h尿蛋白、血BUN、Cr、FN、Col-IV和IGF-1蛋白表达均明显降低，MMP-2明显升高。病理结果也示DN组肾脏肥大较严重，系膜基质大量聚集，予雷米普利治疗后肾脏肥大和基质沉积得到一定改善。提示雷米普利可能通过抑制IGF-1蛋白的表达，从而改善系膜基质聚集，发挥肾脏保护作用。

IGF-1是由第12号染色体编码，70个氨基酸构成，分子量约7500的单链蛋白，同胰岛素有近50%的结构同源性[3]。IGF-1可由肝、肾、骨骼和脂肪等合成分泌，在体内各组织广泛分布；它以自分泌或旁分泌通过与特异性IGF-1受体结合，发挥促进细胞增殖分化，抑制凋亡及促进蛋白质合成等作用，另外其也与胰岛素受体有一定的交叉作用[3]。本研究进一步证实了IGF-1在DN系膜基质沉积中的作用，并提出可能和抑制MMP-2的表达相关，与有关报道[8-12]相一致。

大量研究证实ACEI类药物通过降低肾素-血管紧张素-醛固酮系统的活性，从而改善肾脏血流动力学，发挥保护作用。新近研究发现ACEI可通过非血流动力学因素发挥作用，如减轻炎性反应，降低氧化应激，抑制基质蛋白合成等[13]。本实验结果与已有研究[14]相一致，并进一步提示可能是通过抑制IGF-1的表达来实现。值得注意的是本研究发现雷米普利并未明显改善DN大鼠FBG和HbA1c，提示其对IGF-1的表达独立于血糖改变。

总之，雷米普利可能通过抑制IGF-1在DN肾组织的表达，上调MMP-2的表达，从而减轻系膜基质聚集，延缓DN进展，对临床治疗具有指导意义。

(本文图1见插图2-4)

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Ramipril reduces the accumulation of renal mesangial matrix in diabetic nephropathy rats by inhibiting insulin-like growth factor-1

ZhaoChen*,WangYan,FangYuan,HuangZhenzhen,RenWei,ChenWei,WangLihua,HuWen,WangKe,NiLijun

(*DepartmentofNephrology，AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity，Hefei230001，China)Correspondingauthor：RenWei,Email:renweisn@163.com

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of ramipril on the expression of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and the accumulation of mesangial matrix in diabetic nephropathy (DN) rats.MethodsSD rats were divided into three groups: healthy control group (NC group,n=12),DN group (n=11) and ramipril treatment group (DN+RAM group,n=12).The rat model of DN was constructed by intraperitoneally injected streptomtocin.DN+RAM group was treated with ramipril(3 mg·kg-1·d-1) by gastric perfusion for 3 weeks.The ratio of kidney weight/body weight,fasting blood glucose(FBG),hemoglobin a1c (HbA1c),24-hours proteinuria,blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (sCr) were measured.Pathological changes of renal tissues were observed by HE staining and electron microscope.The expression of IGF-1 and protein expressions of IGF-1,fibronectin(FN),type IV collagen(Col-IV),matrix metalloproteinases(MMP)-2 were detected by immunohistochemistry and Western blot respectively.ResultsAs compared with NC group,ratio of kidney weight/body weight,FBG,HbA1c,24-hours proteinuria,BUN,sCr of DN group increased significantly,glomerular hypertrophy,extracellular matrix accumulation,protein expressions of IGF-1,FN and Col-IV of DN group were significantly elevated,while MMP-2 was significantly decreased(P<0.05).The above parameters except FBG and HbA1c,were all significantly improved in DN+RAM group compared with ND group.IGF-1 protein expression had significant positive correlation with with 24-hours proteinuria(r=0.937),FN(r=0.896) and Col-IV(r=0.871),and negative correlation with MMP-2(r=-0.826) (P<0.05).ConclusionRamipril can play some renoprotective effect in diabetic rats,which maybe related parly to its effect in alleviating the accumulation of renal mesangial matrix through inhibiting IGF-1.

[Key words]Diabetic nephropathies;Insulin-like growth factor I;Ramipril;Rats,Sprague-Dawley糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者常见并发症之一，是终末期肾病的最主要原因[1]。DN特征性病理改变为肾小球系膜细胞肥大、基底膜增厚、细胞外基质过度聚集，引起肾小球进行性硬化，其发病机制复杂，尚未完全阐明[2]。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是由70个氨基酸组成，结构和功能都与胰岛素类似的单链生长因子，具有促细胞分化和增殖以及类似胰岛素的代谢作用；研究报道高糖环境下肾小球系膜细胞IGF-1蛋白表达升高，提示其与DN的发生发展可能密切相关[3]。研究表明血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)可改善系膜基质的合成，降低DN患者蛋白尿，延缓疾病进展[4]，但IGF-1在其中发挥的作用研究较少。本研究拟通过链脲佐菌素(STZ)建立DN大鼠模型，观察雷米普利干预后IGF-1、纤维连接蛋白(FN)、IV型胶原(Col-IV)、基质金属蛋白酶(MMP)-2表达的变化，进一步探讨ACEI治疗DN的可能机制。

基金项目：安徽省2012年度科技计划项目(12070403059)

作者简介：赵宸，博士，医师，Email:zhaochen87@gmail.com通信作者：任伟，主任医师，教授，Email:renweisn@163.com

中图分类号:R587.2

文献标识码:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.026

(收稿日期：2016-01-04)