穆冰瑶,程永静,陈颖娟,王钱,周荣伟,黄慈波

(北京医院风湿免疫科，北京 100730)



·基础研究·

祛风止痛胶囊对博来霉素诱导的小鼠肺间质纤维化模型的影响及机制探讨

穆冰瑶,程永静,陈颖娟,王钱,周荣伟,黄慈波

(北京医院风湿免疫科，北京 100730)

[摘要]目的初步探讨祛风止痛胶囊对博来霉素导致的小鼠肺纤维化模型的影响及机制。方法将54只C57BL/6小鼠按随机数字表法分3组，即正常组、模型组、祛风组，每组18只。1组作为正常对照，2和3组小鼠使用博来霉素诱导肺纤维化模型。分别对2和3组予以0.9%氯化钠注射溶液、祛风止痛胶囊药液灌胃处理，对照组予等量0.9%氯化钠注射溶液灌胃。然后于第7、14、28天分批处死小鼠，每次每组随机抽取6只小鼠，留取血样测定细胞因子，并取小鼠肺作病理观察。结果(1)2组、3组小鼠活动减少，进食，饮水情况亦减少，体质量较1组小鼠减轻。(2)光镜下观察1组未见明显的炎症、纤维化等病理变化，仅于大气道和血管壁周围可见少量蓝色的基质胶原纤维；2组博来霉素诱导的肺纤维化模型成功。3组较2组轻，组间病理评分比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)2组、3组血干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)、白介素-17A(IL-17A)水平较1组升高(P<0.05)，3组炎性因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A水平较2组降低(P<0.05)。结论祛风止痛胶囊对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型的肺泡炎和肺纤维化有抑制作用；祛风止痛胶囊对炎性因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A有抑制作用。

[关键词]肺疾病，间质性；纤维化；博来霉素；模型,动物；中草药

肺间质纤维化的病因及发病机制尚不明确，常有多个病理生理过程及信号通路参与，是免疫紊乱、炎症、纤维化相互交织发展的过程。糖皮质激素作为首选药物被用于临床，但结果表明激素对肺间质纤维化的疗效是有限的[1-2]。有研究使用转化生长因子-β(TGF-β)抗体或抗血清可阻抑TGF-β致纤维化中关键的下游因子-Smad家族，但也仅仅是部分缓解纤维化的进展[3-4]。众多医家尝试用血府逐瘀汤[5]、 复方鳖甲汤[6]等这些有名的活血化瘀方剂甚至单味活血药川芎来治疗肺纤维化，均取得不错疗效。而祛风止痛胶囊可舒筋活血，常用于类风湿关节炎等症。本实验通过研究祛风止痛胶囊对博来霉素诱导的小鼠肺间质纤维化的影响，以探讨其机制。

1材料和方法

1.1实验动物SPF级，C57BL/6，雄性小鼠，购于北京维通利华公司[许可证号：SCXK(京)2012-0001]，年龄：5周龄。

1.2药物与试剂博来霉素A5(BLM)(15 mg/支，日本化药株式会社产)；艾拉莫德片(先声药业有限公司产)；小鼠细胞因子/趋化因子磁珠检测试剂盒(购于上海升联医疗器械有限公司)；Masson染色试剂盒(购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司)。

1.3动物模型制作小鼠在实验室饲养1周，采用4%水合氯醛0.1 mL腹腔注射麻醉，无菌条件下作气管切开，模型组和药物组气管内一次性给予博来霉素(5 mg/kg)，对照组给予0.9%氯化钠注射溶液0.2 mL。给药后，小鼠直立并旋转，使药物充满肺部。

1.4动物分组及给药模型制作成功后，按随机数字表法分为模型组、祛风组。每天分别给予0.9%氯化钠注射溶液2 mL、祛风止痛胶囊0.6g/kg灌胃。即对照组为1组，模型组为2组，祛风组为3组。

1.5标本收集方法三组小鼠分别于术后第7、14、28天各处死6只。开胸取肺并称重，取左下肺叶固定于10%的甲醛溶液中，待HE染色、Masson染色；摘眼球取血行细胞因子检测。

1.6细胞因子测定检测步骤根据上海升联医疗器械有限公司提供的Mouse Luminex Screening Assay试剂盒说明书进行，方法为ELISA检测法。

1.7结果判定标准病理学评分参照Szapiel等[7]的方法对肺组织的肺泡炎及纤维化程度进行评分：1级：1分，无肺泡炎。2级：2分，轻度肺泡炎和肺间质纤维化，单核细胞浸润使肺泡间隔增宽仅限于局部，面积不到全肺的20%，肺泡结构正常。3级：3分，中度肺泡炎和肺间质纤维化，面积占全肺的20%～50%。4级：4分，重度肺泡炎和肺间质纤维化，面积超过全肺的50%，偶见肺泡腔内有单核细胞及出血造成实变。

1.8统计学处理采用SPSS21.0统计软件进行分析，组间比较采用独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般情况对照组小鼠生长良好，除体质量自然增长外，无异常改变；模型组小鼠死亡1只，有体质量减轻、脱毛、行为异常等反应。祛风组无死亡，较模型组情况好。

2.2 肺部病理光镜下观察1组未见明显的炎症、纤维化等病理变化，仅于大气道和血管壁周围可见少量蓝色的基质胶原纤维；2组小鼠第7天肺间质及肺泡腔内可见中性粒细胞、红细胞以及巨噬细胞浸润，肺泡间隔可见淋巴细胞浸润，肺部可见形态扭曲、分布异常的毛细血管增生，成纤维细胞增生，表现为肺泡间隔明显增宽。第14天时可见肺泡腔及间隔内淋巴细胞浸润及中性粒细胞较前减少，而巨噬细胞浸润明显增多，肺泡壁较前增厚明显，而肺泡炎较前减轻，部分肺泡结构消失，成纤维细胞明显增多，可见呈小灶样的染为蓝色的胶原纤维，肺组织新生血管明显增多，且排列紊乱，血管壁较厚。到第28天时肺泡炎症基本消失，肺泡结构破坏明显，肺泡腔消失，大量的纤维组织增生且呈弥漫性分布，并为条索瘢痕样改变，在肺组织间质内可见大量蓝色呈束状或者片状的胶原纤维，并伴有肺泡的融合。3组均有上述表现但均较轻。

2.3肺泡炎评分2组、3组各时间段肺泡炎评分均明显高于1组(P<0.05)；3组随着治疗时间的延长，肺泡炎评分呈下降趋势，第7、14天评分明显低于2组(P<0.05)，第28天肺泡炎评分与2组比较有下降趋势，但差异无统计学意义，见表1。

表1　三组小鼠肺组织病变HE染色评分比较±s，分)

注：与1组比较，aP<0.01；与2组比较，bP<0.01,cP>0.05

2.4肺纤维化评分比较2组、3组不同时间肺纤维化评分均明显高于1组(P<0.05)；3组第14、28天肺纤维化评分均明显低于2组(P<0.05)；3组在第7天时与2组相比差异无统计学意义，见表2。

表2　肺组织病变Masson染色评分比较，分)

注：与1组比较，aP<0.01；与2组比较，bP>0.05,cP<0.01

2.5细胞因子测定IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A分别于造模后第7、14、28天留取血清检测，见表3。

3讨论

祛风止痛胶囊的成分主要为老鹳草、槲寄生、续断、威灵仙、独活、制草乌、红花，常用于类风湿性关节炎(RA)患者，具有较好的抗炎镇痛作用，而RA患者罹患肺间质纤维化的比例为10%～50%，也有报道[8]类风湿关节炎患者随着年龄的增长,其肺功能水平显著下降,表现为小气道功能的严重损伤,并伴有混合性通气功能障碍，且国内尚未有祛风止痛胶囊对于肺间质纤维化的影响的报道。另有研究发现[9]新风胶囊通过诱导免疫抗炎、提高肺组织细胞代谢、激活TGF-β/Smads信号通路及调控Notch信号转导通路可明显改善RA肺功能损伤。祛风止痛胶囊有活血化瘀的作用，其中威灵仙属于化纤汤成分，能够调节细胞内NADH(+)和ATP的水平，从而影响肺泡Ⅱ型上皮细胞等超微结构。也有研究[10]显示红花黄色素辅助治疗对于特发性肺纤维化患者的生活质量有改善作用，且使用安全。而我们的研究中对祛风止痛胶囊治疗肺纤维化的效果进行了观察，尤其是在其发病机制中发挥着重要作用的干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)、白介素-17A(IL-17A)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子。

在本研究中，不同时间点出现2组和3组的小鼠的IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A较1组明显升高，亦表明IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A参与了博来霉素诱导的肺纤维化的致病过程，而3组小鼠的IL-6和TNF-α于第7天、IFN-γ于第14天、IL-17A全程出现较2组明显降低的现象，这证明祛风止痛胶囊对炎症反应有抑制作用。现分析如下：IL-6对机体维持内部自稳态、免疫应答及在炎症反应细胞因子网络中起重要作用，但IL-6过度增高也可造成机体损伤[11]；Ojeda等[12]研究显示IL-6可调节黏附分子及其它细胞因子如TNF-α的表达，以促进炎症反应。IFN-γ在调节成纤维细胞活性的细胞因子网络中起一个复杂的作用，可以抑制由TNF-α和IL-1，IL-4和TNF-β诱导产生的胶原合成[13]，提高纤维连接蛋白的产生。而TNF-α主要通过直接或间接的刺激TGF-β、IL-1、IL-6、CXCL8、CCL2、PDGF 等细胞因子的产生，促进成纤维细胞的增殖。Camara等[14]的研究表明，TNF-α可以显著提高TGF-β对上皮间质转化(EMT)过程的促进作用。而 Sullivan等[15]发现TNF-α在增加TGF-β1mRNA的稳定性和转录两方面都能够促进TGF-β1 的表达。近年来抑制TNF-α的生物制剂也是治疗肺纤维化的研究热点之一。IL-17属于促炎因子，与许多炎症反应和自身免疫性疾病的发生和发展有关[16]。相关研究发现类风湿性关节炎、多发性硬化症、哮喘、狼疮以及在移植排斥反应中IL-17的表达均增加。有人通过实验发现RA患者关节滑液中IL-17和IL-23的含量明显高于骨性关节炎患者滑液中的含量[17]，提示体内高水平的IL-17可能在疾病的发生、发展中起着重要的作用，有可能作为疗效判定的指标之一，并有可能监测疾病的活动性。

表3　三组各细胞因子水平不同时间比较±s,ng/L)

注：与1组比较，aP<0.05；与2组比较，bP<0.05

细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A在博来霉素诱导的肺间质纤维化过程中发挥作用，祛风止痛胶囊可祛风止痛、活血化瘀、减少炎性细胞因子的释放，对肺纤维化相关的炎性因子起到了明显的抑制作用，从而达到防止博来霉素诱导的肺纤维化的作用。

参考文献

[1]Richeldi L,Davies HR,Ferrara G,et al.Corticosteroids for idiopathic pulmonary fibrosis[J].Cochrane Database Syst Rev,2003(3): CD002880.

[2]American Thoracic Society.Idiopathic pulmonary fibrosis: diagnosis and treatment.International consensus statement.American Thoracic Society (ATS),and the European Respiratory Society (ERS)[J].Am J Respir Crit Care Med,2000,161(2 Pt 1): 646-664.

[3]McCormick LL,Zhang Y,Tootell E,et al.Anti-TGF-beta treatment prevents skin and lung fibrosis in murine sclerodermatous graft-versus-host disease: a model for human scleroderma[J].J Immunol,1999,163(10): 5693-5699.

[4]Zhao J,Shi W,Wang YL,et al.Smad3 deficiency attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2002,282(3): 585-593.

[5]徐杰,刘兴奎.血府逐瘀汤防治平阳霉素引起肺纤维化的实验研究[J].中医药信息,2000,17(1):49-50.

[6]孙晓芳，段斐，耿仙.复方鳖甲方对IPF大鼠血清IL-8和TNF-α含量的影响[J].广东医学,2007,28(1):44-46.

[7]Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis,1979,120(4): 893-899.

[8]刘健，万磊，盛长健，等.老年类风湿关节炎肺功能变化及其相关性[J].中国临床保健杂志,2010,13(1):4-8.

[9]刘健，万磊，黄传兵，等.类风湿关节炎患者肺功能变化及中药新风胶囊干预研究[J].中国临床保健杂志,2014,17(1):102-106.

[10] 宋远瑛，李树岗.红花黄色素对于特发性肺纤维化患者生活质量改善的临床研究[J].中国药物经济学,2013,(z1):72-73.

[11] Cid MC.Endothelial cell biology,perivascular inflammation,and vasculitis[J].Cleve Clin J Med,2002,69(suppl 2):45.

[12] Ojeda MO,van't Veer C,Fernandez Ortega CB,et al.Dialyzable leukocyte extract differentially regulates the production of TNFalpha,IL-6,and IL-8 in bacterial component-activated leukocytes and endothelial cells[J].Inflamm Res,2005,54(2): 74-81.

[13] Segel MJ,Izbicki G,Cohen PY,et al.Role of interferon-gamma in the evolution of murine bleomycin lung fibrosis[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2003,285(6): 1255-1262.

[14] Camara J,Jarai G.Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha[J].Fibrogenesis Tissue Repair,2010,3(1): 2.

[15] Sullivan DE,Ferris M,Nguyen H,et al.TNF-alpha induces TGF-beta1 expression in lung fibroblasts at the transcriptional level via AP-1 activation[J].J Cell Mol Med,2009,13(8B): 1866-1876.

[16] Chen Z,Laurence A,Kanno Y,et al.Selective regulatory function of Socs3 in the formation of IL-17-secreting T cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(21): 8137-8142.

[17] Rho J,Takami M,Choi Y.Osteoimmunology: interactions of the immune and skeletal systems[J].Mol Cells,2004,17(1): 1-9.

Effects and mechanisms of Qufeng Zhitong capsule on mice model of bleomycin-induced Pulmonary fibrosis

MuBingyao，ChengYongjing，ChenYingjuan，WangQian，ZhouRongwei，HuangCibo

(DepartmentofImmunologyandRheumatology,BeijingHospital,Beijing100730,China)Correspondingauthor:HuangCibo,Email:huangcibo1208@139.com

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of Qufeng Zhitong capsule in mice model of bleomycin-induced Pulmonary fibrosis.Methods54 C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups after feeding adaptively for 1 week,and the normal group was the group numbered 1,model group was 2,and Qufeng group was 3,with 18 mice every group.The mice of group 2-3 were induced into the pulmonary fibrosis model using bleomycin.The mice of group 2-3 were respectively received the same amount of normal saline and the liquid of Qufeng Zhitong capsule with the gavage way.Then on the 7th,14th and 28th day,6 mice were sacrificed srandomly in each group every time.Collect blood.The blood specimens were used to measure the cytokines and the lung was used for the pathological observation.Results(1)The mice activity ,eating and drinking decreased in group 2 and group 3 and the body weight was also less than the group 1.There was no abnormal situation about activities,eating and drinking of the mice in group 1.(2)There was no significant pathological changes of inflammation and fibrosis observed under light microscope in group 1,a small amount of blue collagen matrix was showed only around airways and blood vessel wall.In group 2 the mice model of bleomycin-induced Pulmonary fibrosis was successful.There were significant differences (P<0.05) between the group 2 and group 3 about the pathological scores with the score of group 3 less than the group 2.(3)IL-6,IFN-γ,TNF-α,IL-17A levels of group 2 and group 3 were higher than those of the group 1,with statistical significance (P<0.05).IL-6,IFN-γ,TNF-α,IL-17A levels of group 3 were lower than those of the group 2 with significant differences (P<0.05).ConclusionsQufeng Zhitong capsule has a inhibition effect on the alveolitis and pulmonary fibrosis of mice models bleomycin-induced pulmonary fibrosis,which may be related its inhibition on the cytokine IL-6,IFN-γ,TNF-α and IL-17A.

[Key words]Lung diseases,interstitial;Fibrosis;Bleomycin;Models,animal;Drugs,Chinese herbal

基金项目：首都卫生发展科研专项项目(首发2014-1-4051)

作者简介：穆冰瑶,医师,Email:Mubingyao_v@163.com通信作者：黄慈波，主任医师,Email:huangcibo1208@139.com

中图分类号:R563

文献标识码:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.025

(收稿日期：2016-01-17)