刘晓，罗庆峰，王振贺，蔡剑平，王化虹

(1.北京大学第一医院消化科，北京 100034；2.北京医院)



幽门螺杆菌感染胃黏膜组织的DNA及RNA氧化损伤水平比较及致癌机制探讨

刘晓1，罗庆峰2，王振贺2，蔡剑平2，王化虹1

(1.北京大学第一医院消化科，北京 100034；2.北京医院)

[摘要]目的通过检测幽门螺杆菌(Hp)感染患者及正常对照人群胃黏膜组织DNA及RNA氧化损伤水平，探讨氧化应激因素在HP感染致癌中的作用。方法60例Hp感染及无Hp感染胃黏膜组织石蜡包埋，切片免疫组织化学法染色，研究级显微镜下观察采集图像，IPP软件定量分析，检测DNA及RNA氧化产物水平，并行统计学分析。结果Hp感染患者与正常人胃黏膜局部RNA氧化水平标记物8-oxoGsn的免疫组化阳性染色OD值分别为0.117±0.015和0.073±0.012，差异有统计学意义；Hp感染患者与正常人胃黏膜局部DNA氧化水平标记物8-oxodGsn的免疫组化阳性染色OD值分别为0.220±0.036和0.210±0.055，差异无统计学意义。结论Hp感染致人胃黏膜局部RNA氧化水平增高，可能与Hp致癌发病机制相关。

[关键词]胃肿瘤；幽门螺杆菌；免疫组织化学；氧化性应激

1994年，WHO国际癌症研究中心将幽门螺杆菌(Hp)列为一级致癌物。目前，关于Hp与胃癌相关性研究的热点很多，氧化应激因素是其中之一。氧化应激反应可能导致上皮细胞DNA损伤，上皮细胞增殖与凋亡失衡，这些都会增加胃癌发病的风险。

一般认为DNA氧化损伤可能引起遗传信息的改变，而RNA氧化后可以快速降解。但是，相较于DNA，RNA面对氧化损伤时显得更为脆弱，因为大部分RNA都处于单链状态，缺少氢键和组蛋白保护，而且RNA在细胞中的分布更接近活性氧和自由基产生的位置。一旦mRNA受到氧化损伤，则有可能通过碱基错配产生变异蛋白而影响细胞正常生理功能。当8-羟基鸟嘌呤核苷酸掺入进RNA时，就可能导致变异蛋白的产生，进而影响机体正常生理功能[1-2]。

本研究中，我们就Hp感染慢性胃炎患者胃黏膜组织局部DNA及RNA氧化水平与无Hp感染的人群做对照，研究Hp感染导致组织局部DNA及RNA氧化水平变化并进一步分析其临床意义。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1标本来源北京医院消化内镜室因上腹不适、消化不良等慢性胃炎症状行胃镜检查，确诊慢性胃炎的60例患者，除外胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌、心肾功能不全、冠心病、糖尿病等。内镜下取胃窦部胃黏膜组织，制作蜡块。以胃镜下快速尿素酶法检测Hp感染情况并切片后免疫组织化学法再次证实Hp感染情况，分为Hp阳性组30例，Hp阴性组30例。所有患者均知情同意。其中，Hp阳性组平均年龄(43.3±5.6)岁，Hp阴性组平均年龄(45.7±3.8)岁。

1.1.2实验试剂鼠抗8-oxoGua 单克隆抗体(15A3)与鼠抗8-oxodG(N45.1)购自美国Abcam公司,DNase-free RNaseA、RNase-free DNase I购自日本TAKARA公司,SP9002系列二抗试剂盒(山羊来源)、抗体稀释液、DAB显色剂购自北京中衫金桥,无水乙醇、二甲苯、柠檬酸、柠檬酸三钠、NaCl、KCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾均购自北京化学试剂有限公司。

1.1.3实验仪器石蜡切片机(德国Leica RM 2235)、烤片机(中国天津天力机电有限公司)、研究级显微镜(日本Nikon公司)

1.2方法

1.2.1组织切片用石蜡切片机切取5 μm切片，捞片后置于烤片机中，70 ℃烤3 h，保存备用。

1.2.2免疫组织化学

1.2.2.115A3染色处理步骤取上述切片于依次置于二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇脱蜡，每个梯度2 min，然后水化10 min。加入1 U/μL DNase I 37 ℃下处理1 h，PBS洗3次，H2O2酶阻断剂(3% H2O2)避光处理15 min，PBS洗3次，山羊血清封闭液封闭30 min，吸弃封闭液，加入15A3抗体(1∶200)，4 ℃过夜孵育，PBS洗3次，二抗处理30 min，PBS洗3次，DAB镜下显色40 s，纯净水终止反应后，75%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性快干胶封片。空白对照组用抗体稀释液孵育过夜。

1.2.2.2N45.1 染色处理步骤脱蜡水化的步骤与15A3相同，水化10 min后，加柠檬酸抗原修复液(pH6.0)微波修复15 min，冷却至室温后，PBS洗3次。5 mg/mL DNase-free RNaseA 37 ℃下处理1 h，PBS洗3次，山羊血清封闭后加一抗(1∶100)4℃下过夜孵育，加二抗、显色与封片的步骤与15A3染色相同。空白对照组用抗体稀释液孵育过夜。

1.2.2.3结果图像采集与相对定量在研究级显微镜下观察采集图像，用Image-Pro Plus(IPP)软件进行定量分析，背景校正后，计算平均吸光度(OD)，该值与染色深度成正比。为保证结果的客观性，各个样品经不同的三个人独立定量计算后获得后，取其三者平均值作为其最终的平均吸光度。所有用于定量的图像均在相同的亮度及曝光条件下采集获取。

1.3统计学处理采用SPSS 19.0软件统计分析，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1RNA氧化水平变化15A3抗体染色结果显示，Hp阳性患者胃黏膜出现较深染色，Hp阴性正常人染色较淡，经IPP软件定量分析统计，差异有统计学意义，见图1及表1。

2.2DNA氧化水平变化N45.1抗体染色结果显示，Hp阳性患者与Hp阴性正常人的染色深浅程度相当，经IPP定量分析统计，Hp阳性患者DNA的氧化水平略高于RNA，但差异无统计学意义，见图2及表1。

表1　DNA与RNA氧化水平定量结果

3讨论

Hp与胃癌相关性的研究热点很多，如环境毒素，宿主因素(热休克蛋白70的表达，环氧化酶的表达，IL-8的基因多态性等)，细菌因素(细胞毒素相关蛋白CagA，空泡毒素相关蛋白A VacA等)，以及增加基因突变的氧化应激因素等。其中，Hp感染引起氧化应激反应的可能来源及机制包括中性粒细胞等炎性细胞、血管内皮细胞、胃黏膜细胞及Hp自身。Hp感染后激活吞噬细胞，通过进一步激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，生成一系列活性氧自由基(ROS)。吞噬体通过产生这些高活性的ROS杀灭入侵的细菌。但若Hp感染的胃黏膜产生的ROS不足以杀灭Hp，吞噬体会生成更多的ROS，过量的ROS反而造成胃黏膜的损伤。

ROS中羟基自由基(·OH)破坏力较强，可对一些碱基进行修饰，而在所有DNA碱基中，鸟嘌呤具有最低氧化势，最易被·OH和单态氧氧化[3]。鸟嘌呤氧化态为8羟基鸟嘌呤(8-oxoG)，8羟基脱氧鸟苷(8-oxodGsn)是鸟苷酸经氧化修饰后的产物，可在DNA子链上引起点突变，因此常作为DNA损伤的标志物。8-羟基鸟嘌呤核苷酸掺入进RNA时，产生的8羟基鸟苷(8-oxoGsn)可引起蛋白变异，产生损伤。

Hp感染引发胃癌的可能机制主要为：(1)上皮细胞DNA损伤；(2)上皮细胞增殖与凋亡失衡。Hp感染引起的氧化应激在两种致癌机制中都有重要作用。此外，氧化应激在促进肿瘤侵袭和转移方面也有重要作用。

在本研究中，我们检测的Hp感染患者胃黏膜局部DNA及RNA氧化产物8-oxodGsn及8-oxoGsn的水平均比无Hp感染者增高，而RNA氧化产物8-oxoGsn水平增高与无Hp感染者相比，差异有统计学意义，DNA氧化产物8-oxodGsn略微增高，与无Hp感染者相比，差异无统计学意义，可见Hp感染后胃黏膜局部氧化应激水平是明显增高的，其中RNA氧化水平增高更显著。

8-oxodGsn是DNA氧化损伤的标记物，在Hp感染的胃黏膜组织、血浆中均会增高，且目前的研究证实，以8-oxodGsn为标志物，测得DNA损伤水平与Hp感染程度及部位相关[4-5]。也有研究证实严重胃炎及胃癌患者组织8-oxodGsn水平增高，并与CagA阳性相关[6]。但目前关于RNA损伤的研究较少。有学者用免疫组织化学及液相-串联质谱法分析研究了人胃癌及癌旁组织RNA氧化损伤水平，8-oxoGsn在癌旁组织中含量低，而在胃癌组织中含量明显增高，提示RNA氧化损伤可能在胃癌的发生发展中发挥作用[7]。也有学者对222例肿瘤患者及134例健康志愿者行血及尿的8-oxoGsn及8-oxodGsn检测，发现肿瘤患者水平明显高于健康志愿者，提示临床上可以此项标记物作为肿瘤筛查的指标[8]。目前，RNA氧化与疾病的关系在国内外已有一些研究，但主要研究对象是神经退行性病变方面疾病[9]。我们的研究发现人Hp感染胃黏膜组织局部RNA氧化损伤水平亦是明显增高，考虑RNA氧化在Hp感染致癌的过程中可能会发挥作用。且就本研究而言，RNA氧化损伤水平较DNA氧化损伤水平更高，提示RNA氧化损伤在Hp感染致癌的过程中可能发挥着更大的作用。

当然，本研究也存在一些不足，样本量偏小，可能对试验结果的判定产生一些影响。此外，未对根除Hp后局部黏膜氧化应激水平变化进行动态观察，也缺乏治疗后的判定。但对目前Hp感染与胃癌发病机制研究来说，RNA氧化水平增高无疑开辟了一条新的道路。

(本文图1，2见插图2-1)

参考文献

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Clinical significance of DNA and RNA oxidative damage in human gastric mucosa infected with helicobacter pylori

LiuXiao*,LuoQingfeng,WangZhenhe,CaiJianping,WangHuahong

(*DepartmentofDigestion,theFirstHospitalofPekingUniversity,Beijing100034,China)Correspondingauthor:WangHuahong,Email:wwwanghuahong@163.com

[Abstract]ObjectiveBy comparing the amount of DNA and RNA oxidative damage detected in human gastric mucosa of helicobacter pylori infected individuals with that of a matched population control.To explore the effects of oxidation in Hp related gastric cancer.MethodsThe gastric mucosa of 60 patients, 30 of patients with and 30 of patients without Helicobacter pylori, were collected and examined via immunohistochemistry. DNA and RNA oxidative damage were detected and analyzed.ResultsThe level of RNA oxidation was significantly higher in patients with Hp(OD=0.117±0.015) than the controls(OD=0.073±0.012)(P<0.05). DNA oxidation was higher in the Hp group as well, but without statistical significance(P>0.05).ConclusionThe increased level of RNA oxidation in Hp infected individuals may be involved in the underlying mechanism of Hp related gastric cancer.

[Key words]Stomach neoplasms；Helicobacter pylori；Immunohistochemistry；Oxidative stress

基金项目：国家人力资源和社会保障部资助课题(人社厅函[2015]192号)

作者简介：刘晓，主治医师，Email:392528423@qq.com通信作者：王化虹，主任医师，教授，Email:wwwanghuahong@163.com

中图分类号:R735.2

文献标识码:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.008

(收稿日期：2016-01-04)

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