蒋莉　刘丹　李为民　陈渤江

(1.川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院呼吸科, 四川 南充 637000)；2.四川大学华西医院呼吸科, 四川 成都 610041)



shAkt2慢病毒表达载体的构建及其对H292细胞增殖和凋亡的影响*

蒋莉1,2刘丹2李为民2陈渤江2

(1.川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院呼吸科, 四川 南充 637000)；2.四川大学华西医院呼吸科, 四川 成都 610041)

【摘要】目的构建shAk2基因慢病毒表达载体，获得稳定干扰Akt2基因的细胞克隆，建立靶向沉默Akt2的非小细胞肺癌稳定细胞株，并探讨Akt2基因在非小细胞肺癌中的作用。 方法根据shRNA干扰序列设计原则，设计并合成针对Akt2靶基因的双链寡核苷酸序列，经退火、酶切、连接反应，将干扰序列插入pLKD.CMV.GFP.U6质粒，经感受态细胞转化、阳性克隆测序鉴定所插入的片段，抽提重组质粒及辅助包装元件载体质粒p-Helper1.0和p-Helper2.0，通过阳离子脂质体lipofectemin2000介导细胞转染及慢病毒包装，收集浓缩病毒进行滴度测定，感染至人肺腺癌细胞H292，通过无菌流式细胞分选GFP强阳性细胞，应用Western-blot验证干扰效果。CCK-8比色法检测细胞增殖，Annexin V．FITC/PI双染法检测细胞凋亡。 结果与正常对照组比较，shAkt2组细胞中Akt2蛋白水平减少90.89%，提示靶向抑制Akt2的慢病毒shRNA表达载体构建成功，并获得稳定抑制Akt2基因表达的细胞克隆。CCK-8法检测细胞增殖能力，shAkt2组细胞在48h，72h，96h及120h的吸光度值明显减低(P<0.05)，干扰Akt2基因表达后显著抑制细胞增殖速率。采用Annexin-V/7-AAD流式细胞分析法检测各组中凋亡细胞的比例，shAkt2组凋亡率显著高于NC及NSCLC组(P<0.05)。 结论靶向干扰Akt2基因表达可抑制肺腺癌细胞株H292细胞的增殖能力，促进其凋亡。

【关键词】非小细胞肺癌; Akt2 慢病毒载体; 细胞增殖; 凋亡

Construction of a recombinant RNA interference lentiviral vector targeting Akt2 and it’s effects on proliferation and apoptosis in H292 cell linesJIANG Li1,2, LIU Dan2, LI Weimin2,etal

(DepartmentofRespiratoryMedicine,NanchongCentralHospital,TheSecondAffiliatedHospitalofNorthSichuan

MedicalUniversity,Nanchong637000,Sichuan,China;

2.DepartmentofRespiratoryMedicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo construct the lentivirus shRNA vector targeting Akt2 and observe the biological behaviors of NSCLC cell lines after Akt2 knockdown and intensify the downstream regulation mechanisms in NSCLC. MethodsSequences for targeting the Akt2 gene was selected. The double strand shRNA oligo was ligated to pLKD.CMV.GFP.U6 lentivirus vector. The construct was verified by sequencing. The viral particles were collected and infected NSCLC cells. After selection of GFP positive cells by FACS, protein expression levels of Akt2 were determined by Western blot. The study was divided into 3 groups, including shAkt2 cells, negative control (NC) and NSCLC normal control groups. Cells were characterized in vitro using proliferation assay and apoptosis analysis. ResultsshAkt2 stable transfected cells were purified by FACS with GFP marker. The ratio of selection was 90%-95%. Efficacy of Akt2 knockdown was determined by western blot. Our data showed that protein expression level of Akt2 was inhibited by 90% compared with control groups, and Stable knockdown of Akt2 in NSCLC cells was successfully established. Knockdown of Akt2 in NSCLC cells significantly inhibited cell proliferation and promoted cell apoptosis in H292 cell lines (allP<0.05). ConclusionShAkt2 could significantly inhibit the Akt2 expression levels in H292 cell lines. Akt2 plays a pivotal role in NSCLC cell differentiation, growth. These results supply new potential therapeutic target for NSCLC intervention.

【Key words】Lung carcinoma； RNA interference； Lentiviral vector； Cell proliferation

Akt是人类染色体基因组中鼠类胸腺淋巴瘤病毒(T-8 strain from AKR/J mouse, Akt8)致癌基因(v-Akt)的同源物，因其蛋白质产物是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与蛋白激酶A、C高度同源，又被命名为蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)[1]。共有Akt1、Akt2、Akt3 3种亚型，分别调节不同的生物学行为。Akt2是Akt的重要亚型，以磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)依赖的方式激活，能磷酸化一系列下游蛋白，通过多种途径调节细胞增殖、分化、转移及凋亡[2，3]。细胞凋亡在肿瘤的进展和耐药中都起到了重要作用，Akt可通过调节下游的凋亡相关蛋白的表达及磷酸化水平参与细胞凋亡途径。研究发现Akt2在肺癌组织中表达增高并与预后相关[4]，但其介导的特异性信号通路尚未阐述清楚。本研究通过靶向沉默Akt2基因的慢病毒表达载体技术，探讨Akt2对肺腺癌细胞株H292细胞增殖能力和细胞凋亡的影响。

1材料和方法

1.1材料人肺癌细胞株H292及人胚肾293T细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；慢病毒载体及包装系统载体pLOV.ubc.eGFP购于纽恩(上海)生物科技有限公司；Enhanced infection solution(ENI．S)、polybrene、含无义序列的shRNA及绿色荧光蛋白(GFP)标记对照慢病毒载体、小干扰序列和引物购于上海吉凯基因技术公司；2000DMEM、FBS购于hyclone；primer(R&F)、Trizol、Lipofectamine、positive clone 测序及逆转录试剂盒购于Invitrogen公司；BamHI、EcoRI等限制性内切酶购于New England Biolabs；SYBR TAQ Real-time试剂盒购于Bio-Rad公司；质粒抽提试剂盒购于Qiagen公司；Cell Counting kit-8 (CCK-8) Dojindo公司；V-APC/7AAD、蛋白抽提试剂盒购于南京凯基生物科技公司，BCA protein assay kit购于Pierce公司；兔抗人AKT2抗体、Western 抗兔二抗购于 Cell Signaling Technology；Luminata Western HRP substrate、PVDF膜购于Millipore公司；预染蛋白Marker购于Fermentas公司。

1.2方法

1.2.1ShAKT2慢病毒载体的构建利用NCBI查找Akt2基因的mRNA序列(NM_001626, 5263 bp mRNA linear)，根据RNA干扰设计序列原则及既往文献报道，采用Invitrogen公司BLOCK-iT在线设计并进行评估测定，选择最佳动力学参数靶点于纽恩公司合成含干扰序列的dsDNA oligo。经分别构建质粒，转染293T细胞，据其对Akt2的抑制率，确定有效靶序列为5′-CCGGGCACAGGTTCTTCCTCAGCT TCAAGAGAGCTGAGGAAGAACCTGTGCTTTT TTg -3′,5′-AATTCAAAAAAGCACAGGTTCTTC CTCAGCTCTCTTGAAGCTGAGGAAGAACCTGT GC -3′。含无义序列的shRNA慢病毒载体作为对照。合成靶片段退火后形成双链DNA，与经Age I和EcoR I双酶切后的pGCSIL-PUR载体相连，转化DH5ct大肠杆菌。挑取重组阳性克隆行聚合酶链反应(PCR)及送测序鉴定。PCR鉴定引物根据Primer 5.0软件设计，Primer(+)：5′-CCTATTTCCCATG ATTCCTTCATA -3′Primer(-)：5′-GTAATACGG TTATCCACGCG-3′。

1.2.2慢病毒重组体的包装取对数生长期的293T细胞，调整细胞密度1.2×107细胞/20ml，接种于15cm细胞培养皿中，37℃、5%CO2培养箱内培养，24小时后细胞密度约70~80%时加pLKD.CMV.GFP.U6质粒、质粒(psPAX2 质粒和pMD2.G 质粒进行感染。48 h后收集病毒上清液，于4℃4000×g离心10 min，再用直径为0.46 μm的PVDF滤膜过滤后，上清分装，用于病毒滴度测定和细胞转染。

1.2.3实验分组正常对照组(H292组)，为未感染慢病毒载体的H292细胞。阴性对照组(NC组)，为阴性对照病毒转染NSCLC细胞。实验组(shAkt2组)，稳定干扰Akt2的NSCLC细胞克隆。

1.2.4.细胞培养、病毒转染和克隆筛选①细胞培养及病毒感染，H292细胞用含10%FBS的RPMI 1640培养基于37℃，5%CO2，的培养箱中培养。细胞生长状态良好后，以5×104/孔接种于6孔板内，培养12~24 h，待细胞汇合度达30%，加入108TU/ml病毒150ul (MOI：75)转染，以GFP标记的慢病毒相同条件同时感染细胞观察感染效率。8 h后更换新鲜培养基。感染后72 h，分别行荧光定量PCR和Western blot免疫印迹检测SLC35F2表达水平。②克隆筛选，流式细胞分选成功感染shAkt2细胞同时表达报告基因GFP蛋白，以GFP为标记获得高纯度稳定转染shAkt2的细胞克隆。

1.2.5Western blot免疫印迹根据凯基生物蛋白抽提试剂盒操作说明抽提细胞蛋白。经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，120 V恒定电压转膜，封闭过夜，Akt2一抗工作浓度1∶1000，二抗工作浓度1∶5000，β-actin一抗工作浓度1∶10 000，二抗工作浓度1∶10000。采用Millipore公司Luminata Crescendo Western HRP substrate显色液孵育3min，放入暗盒(感光时间根据荧光条带的强弱来判定)曝光，取出X光片，放入自动洗片机显影定影后用柯达扫描仪将条带扫描至电脑保存。Quantity one分析软件测定条带灰度。

1.2.6CCK-8检测细胞增殖将对数生长的3组细胞计数并铺板于96孔板上(2×103/孔)，每组3复孔。置于37℃、5% CO2培养箱培养1~4d，每24h测量一次细胞生长状况。测量前，向检测孔加入10μl CCK-8试剂，放入培养箱培养1.5h。酶标仪测定在450nm处的吸光度。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.7Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化收集3组细胞。用PBS洗涤细胞2次(2000rpm离心5min)收集1～5×105细胞。加入500μL的Binding Buffer重悬细胞。加入5μL Annexin V-APC混匀后，加入5 μL 7-AAD染液，混匀。室温、避光、反应5～15min。在1 h内，进行流式细胞仪的观察和检测。激发波长633nm，最大发射波长660 nm，Annexin V-APC的红色荧光使用FL4通道检测；激发波长Ex=546 nm；发射波长Em=647 nm，7-AAD红色荧光使用FL3通道检测。

2结果

2.1Akt2-ShRNA慢病毒载体的鉴定挑选的阳性克隆行PCR鉴定，连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为343 bp，未连接入shRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为：306 bp，鉴定结果与预期相符(见图1)。经两次独立测序证实合成的Akt2-ShRNA寡核苷酸链和阴性对照序列插入正确。

图1pGCsil-shAkt2-GFP质粒菌落PCR电泳图

Fig 1PCR electrophoresis of pGCsil-shAkt2-GFP plasmid colony

注：1.空载体对照组；2.Marker；3，7， 9，10，11，12.阳性克隆；8.测序

挑选重组质粒阳性克隆送至Invitrogen公司测序。结果显示：阳性克隆序列内含有干扰Akt2的shRNA片段序列，片段序列为：CcggGCACAGGTT CTTCCTCAGCTTCAAGAGAGCTGAGGAAGAA CCTGTGCTTTTTg，片段大小为57bp，与之前所设计的针对Akt2的shRNA片段序列完全符合。证明shAkt2序列已成功克隆到慢病毒pLKD.CMV.GFP.U6载体中，见图2。

图2重组pGCsil-shAkt2-GFP质粒测序鉴定

Fig 2Sequencing and identification of recombinant pGCsil-shAkt2-GFP plasmid

2.2RNAi对肺癌细胞H292Akt2基因表达的抑制作用GFP标记的病毒对照转染细胞后48 h即可见较强荧光表达，转染14 d后，仍见强GFP荧光表达(见图3)。说明慢病毒载体高效、稳定的转染效率。Western blot结果同样显示，Akt2蛋白表达明显受到抑制。随后我们使用流式细胞仪对转染的细胞进行筛选，扩大培养1个月后得到稳定克隆，再次进行检测，结果表明Akt2的表达明显减少。

采用逐孔稀释法测定病毒滴度，如图3a为shAkt2慢病毒载体，图3b为空载病毒载体。从上至下依次为病毒原液经倍比稀释感染293T细胞后，明视野及荧光视野下观察细胞GFP表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少，所加病毒体积为10E1μl(10μl),10E0μl(1μl),10E-1μl(0.1μl)。

流式分选，培养皿继续培养3天后分别在明视野、荧光视野下观察细胞GFP荧光表达水平，病毒感染效率大于90%(见图4)。Western blot分析三组细胞Akt2蛋白表达水平； 定量检测各组蛋白条带灰度值， 均以内参条带灰度为参照物，比较各组Akt2蛋白表达水平，与H292及NC组比较，P<0.05，见图5。

2.3Akt2对肺癌细胞H1299增殖的影响CCK-8法检测稳定转染细胞生长曲线(见图6)，结果表明Ak2稳定抑制后对细胞增殖的影响呈时间依赖性。与对照组比较，shAkt2组细胞在48h，72h，96h及120h的吸光度值明显减低(P<0.05)，干扰Akt2基因表达后显著抑制细胞增殖速率。

图3重组shAkt2慢病毒滴度测定

Fig 3Titer determination of recombinant RNA interference lentiviral vector targeting Akt2

图4流式分选后各组细胞病毒感染率及GFP荧光表达水平

Fig 4Lentiviral infection rate and GFP fluorescence expression level of each group after fluorescence-activated cell sorting

图5H292、NC及shAkt2组细胞Akt2蛋白表达水平的比较

Fig 5The Akt2 protein expression detected with Western blot Assay

2.4干扰Akt2表达对NSCLC 细胞凋亡的影响H292细胞株shAkt2组凋亡率显著高于NC及NSCLC组(P<0.05)，而NC与NSCLC组相比，凋亡细胞比例基本一致，无统计学差异(P>0.05)。说明下调Akt2蛋白表达显著促进NSCLC细胞凋亡，慢病毒表达载体对细胞凋亡无影响，见图7。

图6各组细胞生长曲线

Fig 6Growth curves of cells

注：与H292、NC组比较均①P<0.05

3讨论

Akt2基因是Akt家族的重要亚型，已证实其激活后能磷酸化其下游多种底物，通过多种级联反应参与调节肿瘤细胞生长、粘附、运动、侵袭和转移，在肿瘤发生发展及化疗耐药中发挥重要作用[5-9]。慢病毒shRNA(小发夹RNA, short hairpin RNA)表达载体介导RNA干扰因其能够感染广泛的宿主细胞，稳定整合于靶细胞的基因组内，具有表达时间长、靶向性佳，不易诱发宿主免疫反应、安全性好等优点，而成为基因治疗和基因功能研究的重要工具[10,11]。

莆等研究发现Akt2在NSCLC组织中过表达，且磷酸化Akt2表达阳性患者生存时间明显短于表达阴性患者[4]。Miao 等[12]发现，Akt2的表达与NSCLC无病生存率和总的生存率相关，而与临床病理学严重程度不相关；Balsara等[13]对肺癌病人的病理组织进行体外实验，发现Akt2的过度活化对癌细胞局部浸润发挥作用，体内实验也表明，Akt2可以促进肺癌的粘膜下侵蚀和气道内生长。Myoung等[14]应用siRNA技术抑制NSCLC细胞株Akt1、Akt2表达，发现抑制上述基因表达能增加NSCLC对顺铂治疗的敏感性。提示Akt2可能参与NSCLC的发生发展，Akt2有望作为非小细胞肺癌早期诊断和基因治疗的理想靶点。本研究中采用了腺癌细胞株H292，并发现，抑制Akt2蛋白表达能显著抑制H292细胞株的增殖，说明在NSCLC中，Akt2是细胞增殖生长的重要调控因子。Lisa等[15]在对正常小鼠肌细胞及人成纤维细胞的实验中发现Akt2主要参与调控细胞周期，对细胞增殖无作用。这与我们的结果不一致，我们推测，在正常细胞与肿瘤细胞中，Akt2调控细胞存活的方式不同。

为进一步研究Akt2影响H292细胞增殖、生长的途径，我们采用流式细胞分析抑制Akt2基因表达后细胞凋亡的变化。结果发现，下调Akt2基因的表达， H292细胞的凋亡率显著增加。我们推测，Akt2对细胞凋亡的作用是调控细胞增殖的重要环节。Yan等下调Akt2后神经胶质母细胞瘤的凋亡显著增强[16]，这与我们的研究结果一致。

本研究表明，Akt2参与了调控H292细胞增殖和凋亡。但现有的研究没有阐明Akt2在NSCLC体内的作用及机制，且Akt2及其信号通路是怎样调节肿瘤细胞增殖和凋亡尚不清楚。因此，Akt2有望成为NSCLC靶向治疗的候选靶点，但尚需要更深入地进行体内和体外研究。

图7流式细胞分析各组细胞凋亡的水平

Fig 7Effects on apoptosis of each group detected with FACS

注：与H292及NC组比较①P<0.05

4结论

本研究方法获得稳定干扰Akt2基因表达的NSCLC细胞克隆。在NSCLC中，靶向干扰Akt2基因表达抑制NSCLC细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡有望成为肿瘤治疗的新靶点。

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(收稿日期：2015-09-06； 编辑： 陈舟贵)

通讯作者：李为民，教授，本刊副主编。E-mail：weimi003@yahoo.com

基金项目：国家自然科学基金(81372504)；四川省卫计委重点学科科研课题(150092)；川北医学院科研发展计划重点培育项目(CBYI3-A-ZP23)

【中图分类号】R 373

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.01.006