严杜建

（阿克苏职业技术学院生物工程系，新疆 阿克苏 843000）

禽源性大肠杆菌研究进展

严杜建

（阿克苏职业技术学院生物工程系，新疆 阿克苏 843000）

禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌的某些致病性血清型所引起的一种原发性或继发性疾病。临床上常表现为气囊炎、腹膜炎、急性败血症和出血性肠炎等症状。主要从禽大肠杆菌的危害、耐药性、特异性抗体的制备及其应用等方面进行了概述。

大肠杆菌；耐药性；特异性抗体；禽

禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌（Escherichia coli）的某些致病性血清型所引起的禽的一类疾病的总称［1］。近年来，随着我国养殖业集约化程度不断提高，该病已上升为危害我国养禽业最主要的疾病之一。虽然抗菌药物的应用对大肠杆菌病有一定的防治作用，但同时也会加剧大肠杆菌耐药菌株的产生，使得该病的防治变得更加棘手。为了寻求一条有效的防治途径，国内外许多科技工作者进行了大量有关大肠杆菌的药敏试验、耐药机制探讨、特异性抗体的研究及其应用，并已取得了一系列的成果。

1 大肠杆菌对禽的危害

近十几年来，禽大肠杆菌已上升为我国养禽业最主要也是预防最棘手的疾病之一，而且该病常与其他病并发或继发，易造成极高的死亡率［2］。目前已发现产蛋鸭群也流行该病，这也严重影响了蛋鸭产蛋率及其后代的生长发育。近年来的鸭大肠杆菌病血清型调查发现，O1、O2、O3、O78 等血清型就占很大一部分。刘栓江等［3］在对河北定州发病鸭场菌株分离时发现，鸭大肠杆菌的主要血清型是O2和O3型。我国各地区鸭大肠杆菌病流行血清型统计也表明了 O1、O2、O78 占据主要部分［4］。

2 大肠杆菌的耐药性

2.1 大肠杆菌对某些抗菌药物的耐药性 大肠杆菌病临床治疗用药种类繁多，由于这些抗菌药物的滥用，导致大肠杆菌耐药菌株的不断增加，耐药谱也在不断扩大。据统计［5］，20世纪80年代到90年代，大肠杆菌敏感株百分比呈下降趋势；20世纪90年代到2000年，大肠杆菌敏感和中度敏感株比例下降，而耐药株比例增加。张秀英等［6］试验表明，大肠杆菌耐药率基本顺序为：萘啶酸＞四环素＞磺胺甲基异噁唑＞复方新诺明 （甲氧苄啶）＞第2，3代喹诺酮类＞氨苄西林、阿莫西林＞氯霉素、链霉素＞卡那霉素＞头孢噻吩＞庆大霉素＞氟苯尼考＞阿米卡星、头孢曲松。吴志钢等报道［7］，由于恩诺沙星、氧氟沙星、氨苄青霉素等药物的广泛使用，大肠杆菌对其产生了较强的耐药性，而以预防药、添加剂形式添加在饲料中的喹乙醇、痢菌净和氯霉素也加剧了大肠杆菌耐药菌株的产生。

2.2 大肠杆菌的耐药性机制 大肠杆菌是临床上由质粒介导耐药性的主要细菌之一。1959—1960年在日本由Akiba和Ochiai等发现并证实多重耐药性可在大肠杆菌和志贺菌之间互相传递，1962年将该种传递耐药性的因子命名为耐药性因子或R因子。1963年Lebek在研究致病性大肠杆菌时发现了R质粒［8］。1969年Smith曾亲自服用带有R质粒的大肠杆菌，证明R质粒的出现与使用抗生素呈正相关。其后还有很多关于正常人、病人及畜禽R质粒检出情况的报道［9］。这些耐药性质粒介导的耐药菌株主要是通过以下2种方式来使宿主细菌失去对抗菌药物的敏感性：

2.2.1 指令合成钝化酶和同工酶：钝化酶是一类能使抗微生物药物失去或降低抗菌活性的酶，可使药物分解或取代生成没有抗菌活性或不能渗入细胞内的新产物。如大肠杆菌所产生的β-内酰胺酶可以打开青霉素和头孢菌素类药物子结构中的β-内酰胺环，使其完全失去活性，产生的磷酸转移酶、乙酰转移酶及腺转移酶可分别通过羧基磷酸化、氨基乙酰化、羧基腺苷酰化作用使氨基糖苷类药物分子结构发生改变，使之失去作用，如对氯霉素的耐药性即是由于产生乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化而去活性［10］。同工酶则主要是取代菌细胞内已经被抗菌药物颉颃的酶，使阻断的代谢过程恢复，如对磺胺类药物的耐药性就是由于合成二氢碟酸合成酶以代替原有的被磺胺类药物颉颃的二氢叶酸合成酶，同样对甲氧苄啶（TMP）的抗性也是由于合成一种新的不受TMP影响的二氢叶酸还原酶。

2.2.2 改变细胞膜对药物的通透性：例如细胞膜对四环素通透性的改变，是由于质粒指令合成一种新的膜结合蛋白质使四环素外排加强，进入细胞的药物量减少，达不到抑菌浓度，从而产生耐药性。

3 禽大肠杆菌特异性抗体的制备

3.1 禽大肠杆菌特异性抗体的常规制备方法

3.1.1 免疫原的制备：免疫原是制备高效特异性抗体的必要条件。菌株选择是否正确，其免疫原性强弱，决定了抗体的疗效。刘清河等［11］采用常见的致病性大肠杆菌菌株制备了O、K凝集原，随机采集了感染大肠杆菌动物的血清并与制备好的O、K凝集原进行试管凝集试验，根据动物天然抗体凝集效价，了解当地大肠杆菌优势血清型，为制备有效特异性抗体提供了有力依据。另外，也可以直接从发生大肠杆菌的疫地采集病料，在分离鉴定为致病性大肠杆菌后，利用平板凝集试验对大肠杆菌血清型进行粗略鉴定。其方法是［12］，对要分离鉴定的大肠杆菌进行纯化培养后，用少量5%石炭酸生理盐水或0.5%氢氧化钠溶液将菌苔洗下，制成浓稠菌悬液，在121℃高压环境中作用2～2.5 h以破坏其K抗原及H抗原，待其冷却后取1 mL O抗原单价血清（作适当稀释）在玻板上与其混匀，在0.5～1 min内观察结果，出现明显凝集者为阳性反应，同时也应设立阴性对照。上述2种方法对比起来，前者的操作更为简便，能够抓住治疗时机，可以避免造成更大的经济损失。

3.1.2 高免血清的制备：在制备高免血清前，必须考虑实验动物选择问题。若动物在未注射所试验的免疫原之前，就已经在体内存在了该抗体，而事先却没有进行该抗体测定就进行接种，势必会影响结果的判定。所以可采用玻板凝集法或试管凝集试验法检测实验动物血液中是否含有大肠杆菌抗体，只有在测定其不含有大肠杆菌抗体时才可选择其作为实验动物［13］。

动物免疫接种可选用肌肉注射、皮下注射或静脉注射等方法，试验表明，免疫间隔时间和免疫剂量不同，会直接影响抗体产生的效果。同时在免疫过程中，还要严格遵守无菌操作以防抗原被污染及免疫动物被其他病原菌感染。菅新宇等［12］采用5次免疫接种，剂量依次为 0.2、0.4、0.6、1、2 mL，免疫间隔时间为2 d，最后一次免疫后第10天颈动脉采血，用试管凝集试验测得抗血清效价为5 120。苏敬良等［14］采用 4 次免疫接种，剂量依次为 0.5、1、2、4 mL，每次接种间隔时间为5 d，最后一次免疫接种后第10天颈动脉采血，测得效价均在5 120以上。

根据大肠杆菌的免疫特性，动物在接种2 d后就有抗体产生，在第6天达到高峰，以后再进行加强免疫时，就能充分启动动物的免疫应答系统，产生更多抗体，但为了避免抗原与抗体间相互影响，增强免疫接种时应间隔适当时间，根据接种剂量、方法等可选择在 2～10 d 不等［15］。

经免疫接种的动物，在最后一次接种7～11 d后采血。动物在采血前24 h禁食，只供给饮水满足其机体代谢需要，以防血液中血脂浓度过高［13］。

3.2 禽大肠杆菌特异性抗体制备新进展 对大肠杆菌特异性抗体的研究中，张靖飞等［16］从大肠杆菌细胞壁外膜蛋白出发，首先对外膜蛋白进行提取，采用SDS-PAG方法分型，从而确定菌株的血清型，然后用常规方法制备抗体。陈永锋等［17］在该基础上研究证明了O78血清型内相同的不同外膜蛋白型分离株间能获得最大保护，O18血清型内相同的外膜蛋白分离株间也能获得最大保护，但对不同的外膜蛋白分离株间不能提供保护。上述2个血清型分离株间无论膜外蛋白是否相同，均不能提供交叉保护。研究表明［18］，膜外蛋白能够客观反映大肠杆菌分离株的遗传相关性，外膜蛋白在大肠杆菌致病性和免疫中都起重要作用，对膜外蛋白的研究必将成为大肠杆菌病的研究热点。姜平等［19］研究表明，O78和O18的1型菌毛抗原有较大差异，这就为大肠杆菌R质粒的普遍存在性和不同性奠定了充实的依据，同时也为弄清大肠杆菌免疫保护、O血清型及菌体的外膜蛋白型间的关系提供了研究方向。李福玲等［20］在对基础疫苗中的蛋白进行研究时发现，该种基础疫苗的蛋白含有多个保护性多肽抗原结合位点，可以根据这些结合位点的特性，利用基因技术制备出新的疫苗。

4 特异性抗体效价的测定

抗体效价测定是依据细菌菌体与全血或血清中特异性抗体反应而发生凝集形成凝聚颗粒或凝聚块。根据凝聚颗粒或凝聚块多少、大小、抗原抗体混合液透明度来判定抗体的效价［21］。常采用的方法有玻板凝集法和试管凝集试验法，但玻板凝集法更多适用于检查抗原和抗体的有无，多数研究均以试管凝集试验法来判定，其方法是取10个洁净的凝集小管，依次加入0.5 mL的生理盐水。取以1︰10比例稀释的大肠杆菌抗血清0.5 mL加入1号管，混匀后取0.5 mL加入2号管，混匀后又取0.5 mL加入3号管，依次下去，9号管吸取0.5 mL弃去。从10号管开始从右向左依次加入0.5 mL大肠杆菌悬液（10亿/mL）混匀，37℃静置 4～12 h，使抗原抗体充分反应，以50%凝集（细菌部分凝集沉于管底，凝集块呈颗粒状，菌液半澄清）作为判定标准。也有人用微量法测定血清的效价，该试验是在一次性塑料微量试验板中进行，但与试管凝集试验法相比，该方法所用血清和抗原的量都很少。因此，该方法虽然可以降低试验成本和缩短试验时间，但凝集结果不是很显著，易给结果判定造成一定困难。在试验中，通常配合试管凝集试验法使用，而不单独应用。

随着科学技术的发展，酶联免疫吸附试验检测技术的应用也在不断扩大。它是将抗原抗体反应特异性与酶促反应的敏感性相结合而建立的免疫学标记技术。运用于该技术的辣根过氧化物酶（HRP）与大肠杆菌特异性抗体分子可发生共价结合，而且彼此之间互不影响生物化学活性。当抗体与抗原结合后，在溶液中底物的参与下，产生肉眼可见的颜色反应，而颜色反应的深浅程度与溶液中抗原抗体的量成正比［13］，由此即可检测出抗血清效价。

5 大肠杆菌特异性抗体的应用

5.1 免疫预防作用 考虑到大肠杆菌特异性抗体免疫有较强的针对性，在应用其进行免疫接种之前，应对当地或养殖场大肠杆菌致病性血清型作大致调查，根据调查结果选择与其相对应的特异性抗体，这样才能使大肠杆菌特异性抗体产生最好的预防效果。据资料报道，有针对性的免疫接种能更好地刺激免疫系统，活化免疫功能。刘清河等［11］研究表明，用特异性抗体免疫接种动物，不但能预防疾病，还能在一定程度上促进动物的生长发育，这种作用在因抗生素滥用而防治效果不理想的今天，无疑对今后药物的研究有较大临床指导意义。

在应用特异性抗体时，还要把母源抗体的影响考虑在内。对于2周龄内的雏鸭而言，由于其体内尚有较高母源抗体，若在该期间使用特异性抗体，效果会大打折扣。因此，雏鸭初免常选在3周左右，在40～60日龄时再进行一次加强免疫，即可产生较强的免疫力。

5.2 诊断作用 自1975年Mistein和Kohler首先报道应用B淋巴细胞杂交瘤技术制取出单克隆抗体以来，该技术和研究已取得了很大的发展。目前，国内外已用该方法制成多种诊断用的单克隆抗体，大肠杆菌特异性抗体就是单克隆抗体其中的一种。单克隆抗体最大的优点是它只针对一个抗原决定簇，故特异性非常高，抗体分子属于同一类或亚类免疫球蛋白，非常均匀和纯一，易标准化，抗体亲和力不变，重复性强，产量高，易大量制备［22］。

目前，免疫荧光抗体检测（IF）技术也得到了广泛应用。免疫荧光抗体检测是利用抗原抗体反应的特异性与荧光显微技术的精确性、敏感性相结合的免疫学标记技术。当荧光色素与大肠杆菌抗血清中的抗体结合后（在不影响抗体蛋白分子免疫活性条件下）与标本涂片中的特异性抗原结合，最终形成比较固定、不易被缓冲液洗脱的物质，该物质在荧光显微镜下可检测到荧光，由此可判断抗原或抗体的存在和相应菌株分布情况［13］。

总之，随着科技的进步和人们对食品品质要求的不断提高，新的具有有效性、低毒性、病原特异性、增强免疫功能性及良好药物动力学等特征的抗体将会出现，抗体在预防疾病等生命科学中的地位和作用将会显得越来越严重，禽大肠杆菌病必将得到有效地防控。

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Research Progress on Pathogenic Escherichia coli from Avian Origin

YAN Du-jian
（Department of Bioengineering，Aks Vocational and Technical College，Aksu 843000，China）

Avian colibacillosis is a primary or secondary disease caused by infection of Escherichia coli with certain pathogenic serotypes.The clinical symptoms involved in this disease include airsacculitis,peritonitis,acute septicemia and hemorrhagic enteritis,etc.The research progress on pathogenic Escherichia coli from avian origin was reviewed on the aspects of harm,antimicrobial resistance,preparation and employment of specific antibody.

Escherichia coli；antimicrobial resistance；specific antibody；avian

S858.351.2

A文章顺序编号：1672-5190（2016）04-0087-03

2016-01-26

项目来源：阿克苏职业技术学院校级重点项目（KJZ-2015-01）。

严杜建（1979—），男，讲师，硕士，主要研究方向为动物疾病诊疗。

（责任编辑：慕宗杰）